_: Table des Matières Table des Illustrations Figure 0 : Les paramètres de définition de la superhélicité de l' ADN 11 Figure 1 : Activité des différentes Topos 13 Figure 2 : Mécanisme d' action d' une Topo de type IIA 14 Figure 3 : Structure d' une Topo de type IA 15 Figure 4 : Mécanisme d' action de la TopoI 15 Figure 5 : Modèle de Liu et Wang et boucles R 17 Figure 6 : Les différents domaines des Topos de type IIA 20 Figure 7 : Mécanisme d' action des Topos de type II , ici de la gyrase 20 Figure 8 : Rôle de la sous-unité GyrA de la gyrase d' E. coli dans la modification de la superhélicité de l' ADN 21 Figure 9 : Effets sur l' ADN de la protéine H-NS 24 Figure 10 : Mécanisme de répression de la transcription par H-NS 24 Figure 11 : Effet sur l' ADN des protéines courbant l' ADN 25 Figure 12 : Effet antagoniste de HU et H-NS sur un plasmide 26 Figure 13 : Protection de l' ADN par Dps 27 Figure 14 : Effet de la protéine Fis sur la structure du nucléoïde et la transcription 29 Figure 15 : Structure d' un dimère de Fis 30 Figure 16 : Régulation du promoteur de fis 31 Figure 17 : Complémentarité entre l' ARNr 16S et l' extrémité 5 ' non traduite de l' ARNm fis 33 Figure 18 : Région promotrice de rrnB 34 Figure 19 : Modèle d' interaction de Fis avec l' ARN polymérase sur le promoteur rr B P1 34 Figure 20 : Système de recombinaison par Hin 36 Figure 21 : Types de structures formées par MukB 41 Figure 22 : Système rapporteur sensible à la superhélicité de l' ADN 42 Figure 23 : Modèle de compaction du chromosome par H-NS et Fis 44 Figure 24 : Structure des macrodomaines d' E. coli et leur réponse à la topologie de l' ADN 47 Figure 25 : Réorganisation du chromosome en fonction des conditions de croissance 48 Figure 26 : Boucle de régulation homéostatique de la superhélicité de l' ADN 51 Figure 27 : Détermination du fitness de clones évolués par des expériences de compétitions 59 Figure 28 : Effet sur le fitness des allèles évolués topA - 1 et fis - 1 dans le contexte génétique du clone ancêtre 98 Figure 29 : Les régions promotrices des gènes ompF et ompC 107 Figure 30 : Activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase correspondant aux fusions ompFB-lacZ dans différents contextes génétiques isogéniques du clone ancêtre 108 Figure 31 : Activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase des fusions ompFB-lacZ en fonction de la concentration en NaCl 108 Figure 32 : Fixation de Fis sur la région promotrice de ompF 109 Figure 33 : Empreintes à la DNase I de la protéine Fis sur la région promotrice de ompF 110 Figure 34 : Région promotrice de ompF et localisation des sites de fixation de Fis 111 Figure 35 : Activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase des fusions transcriptionnelles ompF K 12 -lacZ dans les contextes isogéniques K12 et K 12 & 226;& 136;& 134; fis 112 Figure 36 : Activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase des fusions transcriptionnelles ompF B- lacZ ou ompF K12 - lacZ dans les contextes génétiques E. coli B ou K12 112 Figure 37 : Activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase des fusions transcriptionnelles ompR - lacZ ou ompC & 226;& 128;& 147; lacZ dans les contextes génétiques E. coli B et K12 113 Figure 38 : Fixation de Fis sur les régions promotrices de ompR ( A ) ou ompC ( B ) 114 Figure 39 : Détermination des sites de fixation de Fis sur les régions promotrices de ompR ou ompC par des expériences d' empreintes à la DNase I 114 Figure 40 : Régions promotrices de ompR ( A ) ou ompC ( B ) et localisation des sites de fixation de Fis 115 Figure 41 : Fixation de OmpR sur ompF 118 Tableau 1 : Nom des souches utilisées dans les 3 parties des résultats 89 Tableau 2 : Modification de l' expression de protéines par les allèles évolués topA et fis isolés dans la population Ara- 1 105 Abréviations ADN : Acide DéoxyRibonucléique ARN ( r , m , t ) : Acide Ribonucléique ( Ribosomique , Messager , de Transfert ) ATP : Adénosine TriPhosphate CTD : Domaine C-Terminal CTP : Cytosine TriPhosphate GTP : Guanine TriPhosphate IPTG : Isopropyl-& 206;& 178;-D-thiogalactopyranoside LB : Luria Broth Lk : Linking number ( nombre de liens ) NAP : Protéine Associée au Nucléoïde NTD : Domaine N-terminal ompF B ou K 12 : Gène ompF d' E. coli B ou K12 OmpR-P : Protéine OmpR phosphorylée RBS : Site de Fixation des Ribosomes TA : Tétrazolium-Arabinose TopoI , III , IV : Topoisomérase I , III ou IV TopoIA , IIA : Topoisomérases de type IA , IIA Topos : Topoisomérases Xgal : 5- bromo- 4- chloro- 3- indolyl-& 206;& 178;-D-Galactopyranoside Glossaire Fitness : capacité de reproduction d' une souche . Fixation d' une mutation : une mutation est dite «  fixée  » lorsqu' elle est portée par la majorité des clones composant la population à un temps donné . Parallélisme de l' évolution : Il s' agit de l' évolution indépendante , et dans une direction similaire , d' un même caractère , dans différentes populations soumises à des environnements équivalents . Le parallélisme de l' évolution peut se refléter à différents niveaux : phénotypique , génétique et moléculaire . Interférence clonale : phénomène observé lorsqu' une population est composée de plusieurs sous-populations cellulaires , portant des mutations différentes mais qui apportent un avantage équivalent . Les sous-populations coexistent , empêchant la fixation rapide d' une des mutations bénéfiques . Lorsqu' une mutation bénéfique supplémentaire apparaît dans une des sous-populations , celle  -ci devient majoritaire ainsi que les mutations qu' elle porte . Ce phénomène ralentit donc la fixation de mutations bénéfiques . Spécialisation écologique : au cours de l' évolution , des fonctions inutiles dans l' environnement de sélection peuvent être perdues ou réduites . Deux mécanismes peuvent expliquer ce phénomène : l' accumulation de mutations ou la pleïotropie antagoniste . Les bactéries sont alors spécialisées pour leur environnement de sélection , et inadaptées à d' autres environnements nécessitant la présence des fonctions éliminées ou réduites au cours de l' évolution . Pleïotropie antagoniste : il s' agit d' un mécanisme conduisant à la spécialisation écologique . Une mutation , sélectionnée pour le bénéfice qu' elle apporte dans l' environnement de sélection , peut avoir des effets néfastes dans d' autres environnements . Elle a alors des effets pleïotropes ( c' est-à-dire multiples ) antagonistes . Accumulation de mutations : il s' agit d' un autre mécanisme conduisant à la spécialisation écologique . Au cours de l' évolution , des mutations neutres , voire faiblement délétères dans l' environnement de sélection peuvent s' accumuler dans des gènes non soumis à la sélection naturelle . Avant Propos La superhélicité de l' ADN peut être considérée , chez tous les organismes vivants , comme une fonction biologique cruciale , réalisée en particulier par des topoisomérases et des histones , qui ont été fortement conservées au cours de l' évolution . Elles contrôlent le niveau de superhélicité de façon adéquate et permettent ainsi à la cellule d' effectuer les réactions indispensables à sa survie et à celle de sa descendance . L' absence totale d' une de ces enzymes est par exemple létale chez la souris ; des maladies génétiques rares , liées au déficit d' une de ces protéines , ont été caractérisées chez l' homme , comme par exemple les syndromes de Werner ( dysfonctionnement d' une hélicase entraînant un vieillissement prématuré et le développement de pathologies liées au vieillissement ) ou de Bloom ( échange d' ADN trop fréquent amenant à un retard de croissance et de nombreux cancers ) . Chez les bactéries , l' altération de ces enzymes peut conduire à des cellules anucléées . Des molécules ciblant les topoisomérases , comme les quinolones , ont d' ailleurs été développées , et sont utilisées contre Plasmodium falciparum , parasite causant la malaria , ou comme antibiotiques . Le maintien d' un niveau précis de superenroulement de l' ADN est primordial . La superhélicité et la structuration de l' ADN au sein de la cellule garantissent l' intégrité du chromosome et sa compaction , mais aussi son accessibilité par différentes enzymes , notamment les polymérases , afin de réaliser toutes les réactions nécessaires à la viabilité de la cellule : la réplication et la réparation de l' ADN , la ségrégation des chromosomes avant la division cellulaire , la transcription globale du génome , et la recombinaison . Les chromosomes sont des structures dynamiques , tant au niveau du degré de superhélicité de l' ADN que de leur organisation spatiale globale . Les conditions de l' environnement ( conditions nutritionnelles et stress thermiques , osmotiques , oxydatifs ... ) sont connues pour affecter cette structuration . Tous les processus vitaux ( réplication , transcription ... ) , mais également la régulation de l' expression des génomes , pourraient donc être orchestrés par la structuration même de l' ADN . Une des principales caractéristiques des bactéries est leur capacité à coloniser toutes les niches écologiques , c' est-à-dire à s' adapter à des conditions de croissance et de stress variées . L' adaptation à de telles conditions requiert une plasticité extrême des phénotypes bactériens . Lors de stress ou de changements d' environnement , ces modifications phénotypiques sont associées à un remaniement total de l' expression du génome , pour s' adapter aux nouvelles conditions . Afin de réaliser cela , il est essentiel pour la bactérie de détecter les conditions de l' environnement et de transmettre ces signaux afin de modifier l' expression du génome . La superhélicité de l' ADN a été suggérée comme intervenant dans l' adaptation à de nouvelles conditions de croissance , de par sa capacité à être modifiée en fonction des conditions et à remodeler l' expression globale des gènes . Le dogme central des sciences de la vie est que les systèmes biologiques émergent d' une évolution darwinienne , c' est-à-dire de modifications génétiques se produisant au hasard dans un génome , suivies de la sélection des individus mutants ayant un avantage sélectif . Si la superhélicité de l' ADN est impliquée dans l' adaptation des bactéries à leur environnement , elle doit donc constituer une cible évolutive , c' est-à-dire une cible de la sélection naturelle . L' objectif de ma thèse est de comprendre les mécanismes d' adaptation des bactéries à leur environnement , et en particulier l' impact de la superhélicité de l' ADN sur les processus évolutifs . Peut -elle être la cible de la sélection naturelle ? Et si oui , par quels mécanismes ? La superhélicité peut -elle être impliquée dans la transmission des signaux de l' environnement à l' expression des gènes , pour permettre une réponse bactérienne adaptée à un environnement donné ? Pour répondre à ces questions , j' ai utilisé une stratégie d' évolution expérimentale , où les bactéries sont adaptées pendant plusieurs dizaines de milliers de générations à des transitions nutritionnelles croissance-carence et carence-croissance , et ce à partir d' un ancêtre bien identifié . Dans l' introduction bibliographique , je présenterai deux parties : la première décrira les différents acteurs protéiques de la superhélicité de l' ADN , l' organisation du chromosome , le rôle de la superhélicité au sein de la cellule , notamment en fonction des conditions environnementales , et enfin son rôle clef dans la régulation de l' expression des gènes . La seconde partie présentera le système d' évolution expérimentale utilisé , ainsi que les résultats obtenus depuis l' initiation de cette expérience . Introduction Partie I La Topologie de l' ADN La relation topologique entre les deux brins d' une même molécule d' ADN , comme par exemple le chromosome circulaire d' Escherichia coli , est caractérisée par le « nombre de liens » , appelé Linking number , Lk . C' est un entier qui est égal au nombre minimal de passages nécessaires d' un des deux brins par l' autre pour leur séparation . A cette fin , il est bien sûr indispensable de casser un des deux brins . Cela signifie que le nombre d' enlacements entre les deux brins d' une molécule d' ADN est constant tant que les deux brins sont intacts , donc Lk est une propriété topologique . L' enroulement de l' ADN est réalisé à deux niveaux de structuration , géométriques . Le tortillement des brins autour d' eux-mêmes au sein de la double hélice est décrit par le paramètre Tw ( pour twist ) ( Figure 0 Ab ) . De ce tortillement va dépendre le pas hélicoïdal de l' ADN , c' est-à-dire le nombre de paires de bases par tour d' hélice . Le vrillage de l' hélice sur elle-même est décrit par le paramètre Wr ( pour writh ) ( Figure 0 Ac ) , qui apparaît lorsque la molécule d' ADN circulaire ne se situe pas dans un plan . Lk est composé de ces deux paramètres , qui sont intimement liés . Une double hélice d' ADN adopte une conformation de moindre énergie entre Tw et Wr ( Figure 0 Ad ) . Un signe est attribué arbitrairement à Lk : positif pour une hélice de pas gauche , et négatif pour une hélice de pas droit ( Figure 0B ) . Chez les bactéries , l' ADN est superenroulé négativement dans la cellule , ce qui permet notamment de condenser une molécule d' ADN de 1 , 5 mm de long dans une cellule d' environ 2 µm . Tous les processus cellulaires vitaux , comme la réplication et la réparation de l' ADN , la transcription , et tous les phénomènes de recombinaison et de transposition , dépendent et influent sur le niveau de superhélicité de l' ADN . En effet , ils introduisent naturellement des boucles ou des noeuds dans la double hélice . La progression de la fourche de réplication ainsi que le déplacement des molécules d' ARN polymérase au cours de la transcription des gènes provoquent également des torsions importantes ( Liu et Wang , 1987 ) . D' autre part , la réplication et la transcription nécessitent l' ouverture de la double hélice d' ADN . L' état thermodynamique le plus stable pour une molécule d' ADN circulaire est l' état totalement relaxé . La superhélicité négative introduite dans l' ADN par différentes enzymes est donc une source d' énergie fabuleuse qui va permettre la réalisation des différents processus cellulaires . En effet , une superhélicité négative correspond à un enroulement de l' ADN inférieur à celui adopté par l' ADN sans contrainte ( Lk 0 ) . Ce phénomène facilite donc l' ouverture de la double hélice . De plus , cette déformation peut également être stabilisée par la fixation de protéines . Tout processus nécessitant ou utilisant ce phénomène , comme la fixation des protéines de type histone ou de l' ARN polymérase , sera ainsi favorisé sur un ADN superenroulé négativement . Cependant , le niveau de superhélicité doit rester précis , une déviation du degré optimal étant rapidement défavorable pour la cellule . Par exemple , une superhélicité négative trop élevée génère des structures d' ADN aberrantes ( extrusion de structures cruciformes au niveau de séquences répétées , triplex d' ADN et des boucles R d' hybridation ADN-ARNm . D' autre part , un niveau de superhélicité négative trop faible génère des problèmes de ségrégation du chromosome et des fonctions chromosomiques déficientes conduisent à la mort cellulaire . Le maintien d' un niveau adéquat de superhélicité du chromosome est donc crucial pour le bon fonctionnement de toute cellule . De plus , sans structuration globale du chromosome , toute altération locale de la superhélicité se propagerait sans limite à l' ensemble de la molécule d' ADN . Afin d' éviter ces « accidents topologiques » , non seulement le niveau de superhélicité est contrôlé de façon précise dans la cellule , mais le chromosome est organisé de façon globale en domaines topologiques séparés par des barrières qui empêchent la propagation de ces altérations ( Espeli et Marians , 2004 ) . Du niveau de superhélicité va également dépendre l' expression d' un grand nombre de gènes : 7 % des gènes d' E. coli sont en effet directement affectés par une diminution de la superhélicité . Parmi ces gènes , certains codent des régulateurs globaux qui , à leur tour , vont avoir des effets variés sur d' autres gènes . De plus , des modifications de l' environnement , comme des stress ( carence nutritionnelle , osmotique , oxydatif , thermique ) , sont connues pour modifier d' une part le niveau de superhélicité , et d' autre part les profils globaux de transcription , permettant une réponse adaptée à ces stress . Superhélicité et transcription sont donc intimement liées . Le niveau de superhélicité est constitué de deux composantes : la superhélicité dont le niveau est contrôlé par les topoisomérases est dite «  non contrainte  » , car sa valeur est conservée après l' action des topoisomérases . La superhélicité « contrainte » est réalisée par des protéines de type histone se liant au nucléoïde , et y induisant des courbures ou des pontages entre molécules . Cette seconde composante est perdue dès que ces protéines ne sont plus liées à l' ADN . Les acteurs de la topologie de l' ADN Les topoisomérases De par leur rôle cellulaire fondamental , les topoisomérases ( Topos ) sont présentes chez tous les organismes vivants . Malgré une différence de séquences considérable entre les enzymes bactériennes , archéennes et eucaryotes , des conformations structurales proches sont toutefois retrouvées dans leurs domaines d' activité ( Champoux , 2001 ; Corbett et Berger , 2004 ) . Il existe deux types de Topos , I et II , chacun divisé en deux familles A et B , mais toutes présentent plusieurs points communs : une structure en forme de pince qui va permettre les activités de coupure de l' ADN et de transfert de brins , une tyrosine catalytique responsable de l' activité de clivage et qui crée une liaison covalente avec l' une des deux extrémités de l' ADN clivé , une cavité de stockage temporaire des fragments d' ADN , et un changement conformationnel associé à une rotation ou un mouvement de l' ADN . Les Topos de type I coupent un seul brin d' ADN ( Figure 1 ) . Les familles IA et IB diffèrent par la liaison formée entre la tyrosine catalytique et l' ADN . Les Topos IA forment une liaison avec l' extrémité 5 ' phosphate de l' ADN , transfèrent l' autre brin et referment la coupure . Ceci a pour effet de changer le paramètre Lk par incréments de 1 ( Brown et Cozzarelli , 1981 ) . Ces Topos sont capables de relâcher les supertours négatifs seulement , mais pas jusqu'à une relaxation complète ( Champoux , 2001 ) . Les Topos IB forment une liaison avec une extrémité 3 ' phosphate de l' ADN . Contrairement aux Topos IA , elles permettent au brin coupé d' effectuer une ou plusieurs rotations autour du brin intact ( Figure 1 ) , ce qui permet des modifications de Lk plus importantes . Elles sont par contre capables de relâcher les supertours positifs comme négatifs , la relaxation étant cette fois  -ci complète . Les Topos de type II sont capables de cliver les deux brins d' ADN et de transférer une double hélice d' ADN , provenant de la même molécule , ou d' une autre , à travers la coupure . Elles utilisent pour cela de l' ATP et le changement résultant pour le paramètre Lk est de 2 ( Figure 1   ; . Elles possèdent des activités diverses de relâchement , de caténation / décaténation , et d' introduction ou de suppression de noeuds . Parmi toutes les Topos , la gyrase est la seule capable d' introduire des supertours négatifs dans l' ADN . La classification en Topos de type IIA et IIB est essentiellement basée sur des considérations structurales . Malgré ces différences , des similarités structurales sont tout de même observées au sein des Topos . Les Topos de type IA , IIA et IIB partagent deux domaines essentiels pour la liaison à l' ADN et sa coupure . Le premier est le domaine 5Y-CAP , appelé ainsi car il se retrouve dans un grand nombre de protéines capables de lier l' ADN , dont la protéine CAP ( Catabolite Activator Protein ) . Le résidu catalytique de ce domaine est une tyrosine qui se retrouve liée de façon covalente à l' extrémité 5 ' de l' ADN après sa coupure . Le second domaine commun à ces Topos est le domaine « toprim » , appelé ainsi car il se retrouve dans certaines Topos mais aussi dans des primases bactériennes , ou encore dans d' autres enzymes qui catalysent des transferts de groupements phosphate ou qui hydrolysent des liaisons phosphodiesters . Il est constitué de 4 ou 5 feuillets & 206;& 178; parallèles entourés d' hélices & 206;& 177;. Un groupement de résidus acides forme un site de liaison pour les ions Mg 2 + , nécessaires à l' action des Topos ( Osheroff , 1987 ) . Après l' assemblage de la topoisomérase , ce groupement se retrouve proche du domaine 5Y-CAP , avec lequel il permet le mouvement des domaines qui ouvrent ou ferment la structure de la protéine et permettent au brin d' ADN de passer entre eux . Les Topos de types II partagent également deux domaines dont les activités sont liées à la fixation et à l' hydrolyse de l' ATP . Le site de liaison de l' ATP est le domaine GHKL , appelé ainsi en fonction des différentes protéines dans lesquelles il se trouve ( Gyrase , Hsp 90 , histidine kinase et MutL ) . Il est composé de 8 feuillets & 206;& 178; couverts sur une face par 5 hélices & 206;& 177; , et d' une boucle riche en résidus glycines . Ce site se dimérise une fois l' ATP fixé et les deux boucles entrent alors en contact , formant une porte pour l' hélice d' ADN ( Figure 2 ) . L' ATP est ensuite hydrolysé par le domaine « transducteur » au niveau d' un résidu lysine . La fixation de l' ATP entraîne une rotation entre les domaines GHKL et transducteur , qui positionne le résidu lysine dans son site catalytique . Cette modification de structure serait un signal pour les régions liées à l' ADN qui dirigeraient alors son passage pendant l' ouverture de l' autre brin . Les Topos de type II sont les cibles de deux types d' antibiotiques : les coumarines et les quinolones . Les coumarines se fixent sur les sous-unités ATPases et entrent en compétition avec l' ATP . Les quinolones se fixent sur l' enzyme complexée à l' ADN et l' immobilisent ainsi ; les complexes extraits à la suite de tels traitements montrent la gyrase liée de façon covalente à l' extrémité 5 ' de l' ADN coupé . Ceci entraîne la fragmentation de l' ADN , aboutissant à la mort cellulaire . Chez E. coli , quatre Topos sont présentes . Deux sont de type IA : la TopoI , codée par topA et la TopoIII , codée par topB . Deux sont de type IIA : la gyrase , codée par gyrA et gyrB , et la TopoIV , codée par parC et parE . Les Topos de type I Mécanisme d' action Les deux Topos de type IA d' E. coli sont monomériques ( Figure 3 ) . Les Topos IA d' E. coli sont composées de 2 domaines essentiels : un domaine N-terminal catalytique formant un tore , pouvant cliver l' ADN et s' ouvrir suffisamment pour transférer un brin d' ADN . Ce domaine contient la tyrosine catalytique en position 319 de la TopoI , mais est incapable de l' activité de relâchement . Les domaines N-terminaux des Topos I et III partagent une grande homologie . un domaine C-terminal participant à la fixation de l' ADN ( Ahumada et Tse-Dinh , 1998 ) , ne montrant par contre aucune homologie entre les deux enzymes . La TopoI possède de plus un domaine central liant les cations Zn 2 + , de 162 acides aminés , indispensable pour l' activité de relaxation . Malgré ces différences , leur mécanisme d' action est très similaire , et nous prendrons ici l' exemple de la TopoI . Le mécanisme de relâchement de l' ADN par la TopoI ( Figure 4 ) a pu être appréhendé grâce à l' obtention de la structure 3D du fragment N-terminal de 67 kDa complexé à l' ADN ( Perry et Mondragon , 2003 ) . Tout d' abord , la TopoI se fixe sur l' ADN superenroulé et déforme la double hélice ( Figure 4 b ) . Un changement conformationnel permet alors le positionnement correct du résidu Tyr 319 qui engendre la coupure de l' ADN ( Figure 4 c ) , et entraîne ainsi la formation d' une liaison covalente entre l' extrémité 5 ' du brin d' ADN clivé et la tyrosine du site actif . Cette coupure provoque alors un changement de conformation qui permet l' ouverture de l' enzyme et le passage du second brin d' ADN dans la cavité de l' enzyme ( Figure 4 d et e ) . Après la fermeture de la cavité de l' enzyme , le brin d' ADN clivé est alors religaturé par la TopoI ( Figure 4 f ) . Un second cycle d' ouverture et de fermeture de l' enzyme libère ensuite l' hélice d' ADN ( Figure 4 g et h ) et l' enzyme retrouve alors sa conformation initiale ( Figure 4 i ) , soit pour se dissocier de l' ADN , soit pour agir de manière processive . Ce mécanisme a pour effet de diminuer la valeur de Lk par incréments de 1 . La principale différence entre la TopoI et la TopoIII réside en deux domaines présents chez la TopoIII et absents de la TopoI. Cette différence pourrait expliquer à elle seule l' activité de décaténation spécifique de la TopoIII . Le premier domaine , de fonction inconnue , correspond aux résidus 241 à 255 . Le second est responsable de l' activité de décaténation , car son remplacement par la séquence homologue de la TopoI élimine totalement cette activité ( Champoux , 2001 ) . Cette boucle , riche en résidus basiques , est localisée près de l' espace défini par le tore du domaine N-terminal . Elle pourrait interagir directement avec l' ADN et permettre à la TopoIII d' agir de manière processive sur des multi-caténanes , ce dont est incapable la TopoI . Fonctions cellulaires La TopoI Son rôle est de limiter un superenroulement négatif trop fort , ce qui est délétère pour la cellule . Cependant , cette enzyme n' est active que lorsqu' un certain niveau de superhélicité négative est dépassé , pour le réajuster à un degré physiologique optimal pour l' expression des gènes . Ceci est réalisé en parallèle de l' activité de la gyrase , qui , elle , introduit des supertours négatifs dans l' ADN . Un équilibre entre les activités de ces deux enzymes est ainsi établi dans la cellule en fonction des conditions et stress rencontrés ( voir paragraphe IV.B ) . Un deuxième rôle majeur de la TopoI dans la cellule a été récemment mis en évidence ( Masse et Drolet , 1999 ) , lié à l' activité de la machinerie transcriptionnelle dans la cellule . Au cours de la transcription , le complexe ARN polymérase-ARN polymérase-ARN progresse le long de l' ADN , qui est ancré à des structures fixes . Or , la progression du complexe requiert de déplacer la bulle de transcription . Pour ce faire , le complexe pourrait effectuer des rotations afin de suivre l' hélice d' ADN , mais celui  -ci , comportant la polymérase , l' ARN et la machinerie traductionnelle , est bien trop imposant pour pivoter . C' est donc l' ADN qui effectue des rotations et , sans l' intervention de Topos pour résoudre ce problème , il s' ensuivrait une accumulation de tours positifs en amont du complexe de transcription et de supertours négatifs en aval ( Figure 5 A ; Liu et Wang , 1987 ) . La TopoI est impliquée dans l' élimination des supertours négatifs qui s' accumulent en aval de l' ARN polymérase au cours de la transcription , la gyrase ayant pour rôle d' éliminer les supertours positifs apparaissant en amont du complexe de transcription ( Liu et Wang , 1987 ) . Une accumulation trop importante de supertours négatifs en aval de l' ARN polymérase entraînerait l' ouverture de la double hélice d' ADN et pourrait favoriser l' hybridation de l' ARNm nouvellement synthétisé avec le brin d' ADN matrice , ces structures ayant été appelées boucles R . L' accumulation de ces boucles R entraînerait soit une inhibition de la transcription en bloquant l' avancement de l' ARN polymérase , soit une inhibition de la synthèse protéique en entraînant la dégradation des ARNs synthétisés et hybridés sur le brin matrice ( Figure 5 B ; Drolet , 2006 ) . Un mutant topA , dépourvu d' activité TopoI , révèle une accumulation de structures de type boucles R ( Masse et Drolet , 1999 ) . La TopoI est donc essentielle dans la cellule , notamment pour l' élimination des supertours négatifs en aval de l' ARN polymérase , ce qui évite la formation de boucles R . Par ailleurs , il a été démontré que le domaine de fixation du zinc de la TopoI était capable d' interagir avec la sous-unité & 206;& 178;'de l' ARN polymérase , ce qui pourrait suggérer que la TopoI soit localisée en aval de l' ARN polymérase au cours de la transcription pour éliminer les boucles R . La TopoI remplit donc au moins 2 fonctions cruciales dans les cellules bactériennes : le maintien d' un niveau adéquat de superhélicité de l' ADN nécessaire à tous les processus vitaux de la cellule , et l' élimination des boucles R pour assurer le couplage transcription & 226;& 128;& 147; traduction . De par ces activités essentielles pour la cellule , des mutants du gène topA pourraient s' avérer non viables . Des analyses génétiques ont effectivement démontré que des mutations de topA ne pouvaient être observées qu' en association avec des mutations secondaires compensatrices dans les gènes gyrA et gyrB , codant pour les deux sous-unités de la gyrase . Les mutations dans gyrA et gyrB diminuent l' activité de la gyrase , ce qui a pour effet de restaurer un niveau de superhélicité physiologique dans un mutant topA. Ces travaux suggéraient donc que le gène topA était essentiel chez E. coli . En revanche , ce phénomène n' a pas été observé chez Salmonella typhimurium et Shigella flexneri , deux autres entérobactéries . Afin d' éviter les mutations secondaires , Stupina et Wang ( 2005 ) ont alors construit et analysé des souches d' E. coli possédant des allèles mutants du gène topA codant des TopoI thermosensibles . Ces gènes topA sont soit sous le contrôle de leur propre promoteur , soit sous le contrôle du promoteur Plac , donc inductibles par l' IPTG dans le second cas . Les souches mutantes sont viables à 37 °C et 42 °C , sans nécessité de mutation compensatoire . En revanche , ce n' est plus le cas à des températures plus basses . Par ailleurs , ces auteurs ont démontré que la viabilité des mutants du gène topA était strictement dépendante de la présence de la TopoIII , l' autre Topo de type IA présente chez E. coli et codée par le gène topB. En effet , des doubles mutants topA topB ne sont pas viables , quelle que soit la température . Deux hypothèses ont été émises pour expliquer l' absence de viabilité des mutants topA à basse température . Une basse température pourrait soit favoriser la formation de boucles R , ce qui nécessiterait la présence absolue de la TopoI , soit réduire de façon additionnelle l' activité déjà faible de relâchement de l' ADN de la TopoIII ( voir paragraphe suivant ) . La nécessité de mutations compensatoires dans les gènes gyrAB lors des premières études était liée à un biais dans la construction des mutations dans le gène topA ( Stupina et Wang , 2005 ) . La TopoIII Les fonctions occupées par la TopoIII ne sont pas encore totalement élucidées . En effet , un mutant pour la TopoIII ne montre pas de phénotype clairement différent chez E. coli . De plus , en raison de la présence de codons rares dans le gène topB d' E. coli , la TopoIII est présente dans la cellule en quantités très limitées ( 1 à 10 molécules / cellule ) , alors que les autres Topos sont 500 fois plus abondantes ( DiGate et Marians , 1989 ) . La TopoIII bactérienne est capable d' effectuer la décaténation des chromosomes-fils au cours de la réplication . Bien que ce rôle soit déjà assuré par la décaténase majeure d' E. coli , la TopoIV ( voir paragraphe I.A. 2 . ) , Nurse et al. ( 2003 ) ont montré que la TopoIII était capable de séparer les chromosomes-fils après réplication dans un mutant de la TopoIV . La TopoIII étant une Topo de type I , elle ne peut couper qu' un seul brin d' ADN . Son activité de décaténation nécessite donc des fragments d' ADN simple brin et se réduit , lors de la réplication , à la période où les fragments d' Okazaki sont encore présents . Les mutants du gène topB présentent un phénotype d' hyperrecombinaison RecA-indépendante , ce qui suggère que la TopoIII soit impliquée dans le contrôle de la recombinaison illégitime . De par son implication dans les phénomènes de décaténation et de recombinaison , la TopoIII pourrait aussi jouer un rôle dans la ségrégation des chromosomes . En effet , des mutants des gènes topA et topB présentent des phénotypes de filamentation avec des structures de nucléoïdes anormales . Cependant , ces structures ne sont pas dues à un défaut de décaténation des chromosomes-fils , car une surexpression de la TopoIV , autre enzyme possédant une grande activité de décaténation , ne supprime pas ce phénotype . En revanche , une délétion de recA résout le problème , ce qui confirme que les Topos de type I pourraient être impliquées dans des phénomènes de recombinaison , probablement au niveau des jonctions de Holliday , qui , en reliant deux molécules d' ADN indépendantes , pourraient générer des tensions lors de l' avancement du complexe de réplication . L' activité de décaténation de la TopoIII permettrait de résoudre de tels problèmes . Les Topos de type II Mécanisme d' action E . coli possède deux Topos de type IIA  : la TopoIV , codée par les gènes parC et parE , a une activité majoritaire de décaténation , mais aussi de relâchement des supertours négatifs comme positifs . La gyrase , codée par les gènes gyrA et gyrB , est la seule Topo à introduire des supertours négatifs dans l' ADN , et peut aussi décaténer l' ADN . Elles sont toutes deux hétérotétramériques de type A2B2 , contrairement aux Topos de type II eucaryotes , qui sont homodimériques ( Champoux , 2001 ) . Les sous-unités GyrB et ParE sont similaires entre elles et contiennent le site de fixation de l' ATP et les domaines transducteur et toprim ( Figure 6 ) . Les sous-unités GyrA et ParC sont elles aussi similaires et comprennent les éléments 5Y-CAP , dans lesquels se situe le résidu tyrosine catalytique . GyrA et ParC forment aussi un élément appelé « porte C » , ou C-gate ( Figure 6 ) , ainsi qu' un domaine globulaire à l' extrémité C-terminale spécifique aux Topos de type II bactériennes , qui se lie à la double hélice d' ADN fixée qui sera ensuite transférée ( Champoux , 2001 ; Corbett et Berger , 2004 ) . Le mécanisme d' action de la gyrase est le suivant : l' ADN qui sera clivé ( double hélice G pour Gate ) vient d' abord se fixer aux éléments catalytiques toprim et 5Y-CAP ( Figure 6 et 7.1 ) . L' enroulement d' environ 140 pb d' ADN autour des domaines C-terminaux ( CTD ) des deux sous-unités GyrA ( Figure 7 . 2   ; suivi d' un changement de conformation au niveau des domaines GHKL et transducteurs , formant le domaine ATPase , permet de capturer une seconde double hélice ( T pour Transfer ) dans une configuration de supertour positif ( Figure 7 . 2 , vue de dessus et Figure 7 . 3 ) . Ceci nécessite deux molécules d' ATP et entraîne la coupure de l' hélice G à travers laquelle est alors transférée l' hélice T ( Figure 7 . 4 ) . Ce transfert a pour effet d' inverser la configuration de supertour positif , et crée ainsi deux supertours négatifs . Cette inversion est permise par un autre changement de configuration , un abaissement d' un des domaines CTD des sous-unités GyrA qui sont reliés aux domaines N-terminaux par une région flexible ( Figure 8 ; Schoeffler et Berger , 2005 ) . L' hélice G est ensuite religaturée puis la double hélice T est probablement libérée par l' ouverture des portes C ( Figure 7 . 5 ) . Si les doubles hélices G et T font partie de la même molécule d' ADN , le niveau de superhélicité Lk de celle  -ci sera modifié par incréments de 2 . En revanche , si les deux doubles hélices correspondent à deux molécules d' ADN différentes , l' activité ainsi générée sera une caténation ou une décaténation . Le mécanisme d' action de la TopoIV , qui , contrairement à la gyrase , relâche l' ADN , est similaire à celui de la gyrase à deux exceptions près . Tout d' abord , il n' y a pas d' enroulement de l' ADN , qui est dû , pour la gyrase , à la présence au niveau du CTD de GyrA d' une « boîte GyrA » de 7 acides aminés , absente chez la TopoIV ( Figure 7 . 2   ; Kramlinger et Hiasa , 2006 ) . Deuxièmement , la flexibilité du CTD est propre à GyrA et permet l' ajout de supertours négatifs à l' ADN après abaissement d' un des deux domaines ( Figure 8 B ) . La TopoIV , ne possédant ni cette activité d' enroulement ni la possibilité d' abaissement des CTD de ParC , ne peut introduire de supertours négatifs à l' ADN . Fonctions cellulaires La gyrase La gyrase étant la seule enzyme capable d' introduire des supertours négatifs dans l' ADN , sa fonction est essentielle . Elle est nécessaire à l' initiation de la réplication de l' ADN et de la transcription , car l' augmentation de superhélicité négative permet d' abaisser la quantité d' énergie requise pour l' ouverture de la double hélice . De plus , elle convertit en supertours négatifs les supertours positifs qui sont générés en amont des complexes de réplication et de transcription ( Liu et Wang , 1987 ) , ce qui est essentiel à la progression de la fourche de réplication et de l' ARN polymérase . La gyrase est donc une enzyme essentielle et les mutations dans les gènes gyrAB sont conditionnelles et létales , l' incubation à la température restrictive provoquant un arrêt de la réplication de l' ADN , et donc la mort cellulaire ( Kreuzer et Cozzarelli , 1979 ) . Certains de ces mutants entraînent une augmentation de la recombinaison illégitime , ce qui implique la gyrase dans les phénomènes de recombinaison . Le modèle d' échange de sous-unités de gyrase a été proposé , selon lequel la gyrase se fixe et clive l' ADN , avec chaque sous-unité GyrB liée de façon covalente à l' extrémité 5 ' de l' ADN . Un échange de sous-unités entre plusieurs molécules de gyrase fixées à des sites différents de l' ADN aboutirait à un échange de brins d' ADN et donc à un événement de recombinaison . Des sites de reconnaissance de la gyrase sont présents sur les chromosomes bactériens , sur les plasmides ou l' ADN des bactériophages . Dans le cas de l' ADN du bactériophage Mu , des sites SGS ( Strong Gyrase Site ) sont présents , et la fixation de la gyrase sur ces sites permet l' alignement des extrémités de Mu , et donc sa transposition ( Sokolsky et Baker , 2003 ) . La topoisomérase IV La TopoIV est principalement responsable de la décaténation de l' ADN , notamment au cours de la réplication ( Hiasa et Marians , 1996 ) , mais aussi lors des processus de recombinaison site-spécifique . Elle est également impliquée dans la ségrégation des chromosomes pendant la réplication . La TopoIV joue aussi un rôle dans le contrôle du niveau global de superhélicité de l' ADN . Ce rôle a longtemps été occulté car les inhibiteurs ( coumarines et quinolones ) utilisés contre la gyrase inhibent aussi la TopoIV . Zechiedrich et al. ( 2000 ) ont montré que l' absence simultanée des activités TopoI et TopoIV entraînait un niveau de superhélicité plus élevé que l' absence de la TopoI seulement . De plus , bien que la TopoI ait une activité de relâchement plus importante que la TopoIV , seule cette dernière permet un relâchement complet d' une molécule plasmidique circulaire . Comme dans le cas de la gyrase , des mutations dans les gènes parC et parE sont létales conditionnelles . Les cultures de ces mutants à la température restrictive résultent en l' absence de ségrégation des chromosomes qui s' accumulent donc au centre de cellules élonguées . Les protéines de type histone Mises à part les topoisomérases , des protéines de type histone , aussi appelées NAP ( Protéines Associées au Nucléoïde ) ( Dorman et Deighan , 2003 ) , interviennent dans la structure et l' état de superenroulement du chromosome . Chez E. coli , il y en a 5 majeures  : Dps , Fis , H-NS , HU et IHF . Elles assurent la compaction et la condensation du chromosome en une structure appelée nucléoïde . Elles peuvent remplir différentes fonctions dans la cellule , mais leur point commun est de lier l' ADN et de modifier sa superhélicité de façon globale ou locale , en introduisant une topologie contrainte . Certaines de ces protéines peuvent courber l' ADN , comme IHF , HU ou Fis , alors que d' autres établissent des ponts entre molécules d' ADN , comme H-NS ou Dps . Les profils de fixation à l' ADN ont été réalisés pour 3 protéines de type histone ( Fis , H-NS et IHF ) par immunoprécipitation de la chromatine associée à des puces à ADN . Des centaines de sites de fixation ont été mis en évidence sur le génome d' E. coli . Environ la moitié de ces sites sont localisés dans des régions intergéniques , qui représentent moins de 10 % du génome d' E. coli , ce qui pourrait indiquer une préférence pour ces régions , et donc un rôle de ces protéines dans l' organisation générale du chromosome ( voir paragraphe II.A. 4 ) . Une préférence de fixation pour les régions riches en AT , qui peuvent présenter une courbure intrinsèque , a également été observée , ainsi qu' une association avec les régions promotrices . De plus , des interactions ont été récemment mises en évidence entre certaines NAPs et des sous-unités de l' ARN polymérase et des ribosomes . Ainsi , en plus de leur rôle dans le contrôle de la superhélicité de l' ADN , certaines NAPs sont également connues pour être des régulateurs de la transcription d' un grand nombre de gènes ( Dorman et Deighan , 2003 ) . Elles peuvent en outre affecter le superenroulement de l' ADN par la régulation des gènes de topoisomérases . Comme nous le verrons au paragraphe III , un lien étroit existe donc entre le niveau de superhélicité du chromosome et la transcription globale des gènes . Enfin , les NAPs sont exprimées différentiellement au cours du cycle cellulaire . De par leur rôle dans le contrôle de la superhélicité de l' ADN et sur la transcription , les NAPs vont entraîner une dynamique importante du nucléoïde bactérien et de l' expression globale des gènes . Les propriétés et fonctions des 5 NAPs majeures sont décrites dans les paragraphes suivants . Les NAPs ne possédant aucune spécificité de fixation H-NS ( Histone-like Nucleoid Structuring protein ) La protéine de type histone H-NS se fixe de manière non spécifique à l' ADN , bien qu' une préférence pour des séquences riches en AT présentant une courbure ait été suggérée . Après fixation , elle provoque la condensation de l' ADN chromosomique et contraint des supertours négatifs in vitro . En effet , des mutants dépourvus de H-NS présentent une diminution de la superhélicité globale . La protéine H-NS est composée de deux domaines de fonctionnalités différentes , séparés par une partie flexible ( Figure 9 ) . Le domaine C-terminal est impliqué dans la liaison à l' ADN , alors que le domaine N-terminal permet l' oligomérisation de la protéine ( Dame , 2005 ) . H-NS se fixerait à l' ADN sous forme de dimères , mais il a été montré que des oligomères pouvaient se former in vitro , qui pourraient servir de squelette pour compacter l' ADN ( Dorman , 2004 ) . En effet , les dimères s' oligomériseraient après fixation à l' ADN , et une structure du type « fermeture éclair » pourrait se former , aboutissant à la condensation de l' ADN ( Figure 9 ) . Ces propriétés de H-NS sont à l' origine d' une activité de répression de l' expression des gènes . En effet , des études génétiques et moléculaires ont montré qu' H-NS était un régulateur global de l' expression des gènes , affectant environ 5 % des gènes d' E. coli , la plupart étant réprimés . Le mécanisme de cette répression a été explicité dans le cas du promoteur P1 des opérons d' ARN ribosomiques ( Figure 10 ; Dame et al. , 2002 ) . La caractéristique des promoteurs réprimés par H-NS serait d' être flanqués de régions possédant un fort potentiel de courbure . La fixation de l' ARN polymérase sur ces promoteurs ( Figure 10 i ) entraînerait le rapprochement des régions flanquantes intrinsèquement courbées ( Figure 10 ii ) . H-NS présentant une préférence de fixation sur les séquences d' ADN courbées , plusieurs dimères d' H-NS pourraient alors se fixer sur l' ADN , piégeant ainsi l' ARN polymérase ( Figure 10 iii ) . Ces complexes ne pourraient se séparer qu' après l' intervention d' activateurs de la transcription ou dans certaines conditions ( Figure 10 iv ) , comme une élévation de température ou d' osmolarité , qui sont par ailleurs connues pour modifier la superhélicité de l' ADN ( voir paragraphe IV.A ) . Ainsi , le degré de superhélicité de l' ADN va affecter la transcription des gènes réprimés par H-NS , ce qui souligne encore le lien entre superhélicité de l' ADN , protéines de type histone et transcription globale des gènes . Un certain nombre de gènes peuvent également être activés par H-NS . Il s' agit essentiellement des gènes régulés négativement par ( p ) ppGpp , qui est l' effecteur de la réponse stringente , permettant l' adaptation des bactéries aux périodes de carences nutritionnelles . Le mécanisme par lequel H-NS active ces gènes serait lié à sa capacité à augmenter le superenroulement de l' ADN . Au cours de la croissance chez E. coli , la quantité de H-NS diminue , passant de 20 000 molécules en phase exponentielle à 8000 en phase stationnaire . Son expression est fortement activée en cas de baisse de la température ( Free et Dorman , 1995 ) . Un paralogue de H-NS est également présent dans les bactéries gram-négatives . Cette protéine , appelée StpA chez E. coli , présente 58 % d' identité de séquence avec H-NS . Elle partage certaines fonctions de régulation et de maintien de la superhélicité avec H-NS . Ces deux protéines peuvent former des hétérodimères in vivo , ce qui pourrait altérer leurs fonctions respectives ( Cusick et Belfort , 1998 ) . HU ( Histone-like protein from E. coli strain U93 ) HU a été initialement isolée chez E. coli comme étant capable de former des structures de type nucléosome ( Rouviere-Yaniv et Gros , 1975 ) , sans reconnaître de séquence particulière de l' ADN . En revanche , HU semble se fixer préférentiellement sur l' ADN superenroulé négativement . L' étude des effets de HU sur la structure de l' ADN ont conduit à des résultats controversés . HU se lie à l' ADN et y induit une courbure d' environ 160 ° ( Figure 11 B ) , ce qui provoque la compaction de molécules d' ADN in vitro . De plus , HU est attirée par des structures spécifiques d' ADN , comme des jonctions en croix ou des coupures simple brin , ce type de liaison à l' ADN lui donnant un rôle dans les processus de recombinaison . In vivo , HU semble également compacter l' ADN , car des souches dépourvues de cette protéine sélectionnent des mutations secondaires dans gyrB qui augmentent la capacité de superenroulement de la gyrase . Ceci a été interprété comme un phénomène de compensation pour pallier une perte de superhélicité engendrée par l' absence de HU . Cependant , à fortes concentrations , HU donne un aspect circulaire relâché à l' ADN ( Dame et Goosen , 2002 ) . HU pourrait alors avoir un effet sur le pas de l' hélice d' ADN , qui serait constitué de 10 , 9 pb par tour d' hélice au lieu de 10 , 5 pb . Cet accroissement se ferait par la contrainte de supertours négatifs supplémentaires ( Dame et Goosen , 2002 ) et entraînerait une rigidification de la double hélice . A plus basses concentrations , HU a un effet de courbure sur l' ADN , et l' aspect circulaire est alors moins rigide ( Figure 11 B ; . En plus de son rôle structural , HU est impliquée dans l' expression des gènes . De profonds changements de la transcription globale ont été détectés chez les mutants HU , ainsi que des modifications morphologiques des cellules mutantes . Par son rôle structural sur l' ADN , HU est par ailleurs connue pour assister certains régulateurs au niveau de leur promoteur . Par exemple , HU permet l' interaction entre des dimères du répresseur GalR pour conduire à la répression des gènes gal ( Kar et Adhya , 2001 ) . La protéine HU est présente en quantités abondantes dans la cellule , de 30 000 à 55 000 molécules en phase exponentielle . Lors du passage en phase stationnaire , le nombre de molécules de HU diminue pour passer à moins de 20 000 molécules . Chez la plupart des bactéries , HU est un homodimère , alors qu' elle existe sous forme d' hétérodimère chez E. coli . Les deux sous-unités sont codées par les gènes hupA et hupB. Des formes homodimériques ont également été mises en évidence chez E. coli . Leur fonction n' est pas connue , mais pourrait influer sur les propriétés des dimères de HU . Enfin , les deux NAPs HU et H-NS exercent des effets antagonistes dans la cellule ( Figure 12 ) . Alors que H-NS compacte et condense l' ADN , HU lui donne une forme circulaire rigide . De plus , la capacité de H-NS à réprimer la transcription d' un certain nombre de gènes est accrue dans les mutants dépourvus de HU , cette dernière étant capable de lever la répression de ces gènes ( Dame et Goosen , 2002 ) . Dps ( DNA-binding Protection from Starved cells ) La protéine Dps se lie de façon non spécifique à l' ADN , et sa principale fonction est de le protéger pendant les périodes de stress , dont la phase stationnaire . Alors que seulement 6000 molécules de Dps sont présentes chez E. coli en phase exponentielle , près de 200   000 molécules ont été dénombrées en phase stationnaire , ce qui en fait la protéine la plus abondante de la cellule . Sur des bases structurales , Dps est considérée comme un membre des bactérioferritines , chaque monomère formant une structure entrelaçée de 4 hélices . Dps est formée de 12 de ces monomères formant une sphère creuse ( Figure 13 ) , ces sphères s' assemblant ensuite en nids d' abeilles . La surface ainsi formée ne présente pas de domaine spécifique de fixation à l' ADN , mais des résidus lysines , chargés positivement et présents dans les pores situés entre les sphères , pourraient interagir avec l' ADN . La liaison à l' ADN pourrait induire des interactions entre dodécamères de Dps , conduisant à la formation de couches superposées de Dps et d' ADN . La formation de ces structures très organisées permettrait une forte compaction de l' ADN . Les effets de Dps sur la structure de l' ADN ont été visualisés par microscopie . Après 24h de carence nutritionelle , des structures toroïdale Dps-ADN sont formées ; après une phase stationnaire prolongée de 48h , ces structures laissent place à des cristaux où les couches de Dps et d' ADN sont alternées ( Figure 13 ; Frenkiel-Krispin et al. , 2004 ) . Les structures formées par Dps permettent de protéger l' ADN des stress oxydatifs , thermiques , et des radiations UV . Dps fait d' ailleurs partie du régulon de OxyR , celui de la réponse aux stress oxydatifs . Pendant de tels stress , cette protection stérique serait couplée à une protection chimique , grâce à la liaison des ions Fe 2 + à Dps . En effet , les stress oxydatifs sont associés à la production de radicaux libres , toxiques pour les cellules , via les réactions de Fenton impliquant les ions Fe 2 + . Ces radicaux peuvent notamment conduire à des cassures simple brin ou double brin de l' ADN par oxydation des bases nucléotidiques . Dps est capable de séquestrer les ions Fe 2 + et ainsi d' empêcher la production de radicaux libres . La protéine IHF La protéine IHF ( Integration Host Factor ) est la NAP présentant la plus forte spécificité de fixation à l' ADN avec une séquence consensus clairement définie , qui ressort de l' analyse de plusieurs sites de fixation ( Dorman et Deighan , 2003 ) . IHF est un hétérodimère dont les sous-unités & 206;& 177; et & 206;& 178; sont codées par les gènes himA et himB et dont la séquence et la structure ressemblent à celles de HU . IHF se fixe sur une séquence de 30 pb , dont 13 sont conservées , et y induit une courbure allant jusqu'à 180 ° ( Figure 11 A ; . Seuls 1000 sites de fixation à haute affinité pour IHF sont présents sur le chromosome , alors que 12   000 molécules d' IHF sont présentes chez E. coli en phase exponentielle , et 55   000 en début de phase stationnaire . Un fort excès d' IHF est donc présent par rapport à ses sites de haute affinité . IHF pourrait donc également se fixer à l' ADN par des interactions non spécifiques , car la majorité d' IHF in vivo est liée à l' ADN ( Yang et Nash , 1995 ) . La fixation d' IHF à l' ADN in vitro provoque une réduction de la longueur de l' ADN de 30 % , liée à l' activité de courbure d' IHF et conduisant à la compaction de l' ADN . L' expression maximale d' IHF lors du passage en phase stationnaire permet d' envisager la compaction du chromosome par IHF à ce moment du cycle cellulaire , avant que Dps ne prenne le relais . En plus de son rôle structural d' organisation de l' ADN , IHF est impliquée dans les phénomènes de régulation de la transcription chez les bactéries , la réplication de l' ADN , la recombinaison site-spécifique ( Dorman et Higgins , 1987 ) , et la transposition . Son activité de courbure est cruciale pour ces fonctions additionnelles , car elle induit des interactions à grande échelle entre différentes protéines . D' autre part , l' influence d' IHF sur la structure de l' ADN contribue notamment au contrôle de la transcription . Ainsi , la liaison d' IHF sur un de ses sites de fixation en amont du promoteur ilvPG améliore l' ouverture de la bulle de transcription en transférant la tension induite par la courbure de l' ADN de sites riches en AT en amont du promoteur vers celui  -ci . Des profils globaux de transcription ont été réalisés chez S. typhimurium afin de comparer la souche de référence et des mutants dépourvus d' IHF . De profonds changements de la transcription ont été observés suite à l' absence d' IHF , les gènes affectés étant notamment impliqués dans la transition entre les phases exponentielle et stationnaire , mais aussi dans la virulence et l' invasion des cellules épithéliales , ce qui montre le rôle d' IHF dans la régulation coordonnée des traits pathogéniques et de l' adaptation aux carences . La protéine Fis La protéine Fis ( Factor for Inversion Stimulation ) , un homodimère de 98 acides aminés , fut découverte dans les années 1980 chez E. coli et S. typhimurium pour son implication dans les phénomènes de recombinaison site-spécifique . Depuis , un grand nombre de fonctions lui ont été attribuées dans la cellule , et elles ont pu être corrélées à sa structure , connue depuis 1991 . Rôle de Fis dans la superhélicité de l' ADN Des sites à haute affinité pour Fis ont été mis en évidence , ce qui a permis de déduire une séquence consensus de fixation de Fis sur l' ADN , de 15 pb . Cette séquence est cependant très dégénérée . De plus , le nombre de sites à haute affinité répertoriés sur le chromosome d' E. coli , estimé à 6000 , est bien inférieur au nombre de molécules de Fis dans la cellule en phase exponentielle ( plus de 50 000 molécules ) . Ainsi , Fis est également capable de se fixer de manière non spécifique à l' ADN , avec une préférence pour des régions courbées . La fixation de Fis sur l' ADN provoque une courbure de 50 à 90 ° , ainsi qu' un phénomène d' extrusion de boucles de l' ADN ( Figure 11 C ; Schneider et al. , 2001 ) . La capacité de Fis à se fixer de manière à la fois non spécifique et sur des sites à haute affinité lui permet d' influer sur la topologie de l' ADN aussi bien au niveau global que local . En effet , de par sa capacité à se fixer de façon non spécifique et à former des « branches » et des boucles d' ADN , Fis est impliquée dans la structuration globale du chromosome . Ainsi , Fis forme des barrières qui contribuent au maintien de domaines topologiques , et son absence engendre un relâchement général du chromosome ( voir paragraphe II.A. 4 ; Hardy et Cozzarelli , 2005 ) . Au niveau local , Fis se fixe sur des sites de reconnaissance à haute spécificité , qui sont souvent localisés dans les régions promotrices de certains gènes , ce qui fait de Fis un régulateur global de la transcription ( Dorman et Deighan , 2003 ) . Ces sites de fixation sont appelés Upstream Activating Sequence ( UAS ) et ont été particulièrement bien étudiés dans le cas des opérons d' ARN ribosomiques , qui sont activés par Fis . Leur région régulatrice possède en effet plusieurs sites de fixation de Fis qui sont séparés par une distance correspondant au pas de l' hélice , le site majeur étant localisé à la position - 71 par rapport au site d' initiation de la transcription . Cette structuration des UAS leur permet d' être tous localisés du même côté de la double hélice d' ADN . La fixation de Fis sur ces UAS entraîne des courbures de l' ADN et la formation de boucles d' ADN , ces boucles favorisant la fixation de l' ARN polymérase . Elles pourraient donc favoriser la transcription des opérons d' ARNr par l' intermédiaire de Fis . Ainsi , les deux effets de Fis sur l' ADN , aux niveaux global et local , impliquent le même mécanisme structural : une forte courbure de l' ADN avec pour conséquence la formation de boucles ( Figure 14 ; Muskhelishvili et Travers , 2003 ) . Un autre exemple est constitué par la région promotrice de tyrT , qui contient trois sites où Fis se fixe de manière coopérative . L' effet de cette fixation est de stimuler l' ouverture du promoteur , probablement à l' aide de la torsion introduite par les trois dimères de Fis . L' effet local de Fis sur les promoteurs possédant des sites de fixation à haute affinité serait de moduler , en l' augmentant , le superenroulement local de l' ADN de ces promoteurs . De cette façon , Fis permettrait à ces promoteurs de rester actifs même si la superhélicité globale de l' ADN devenait défavorable à la transcription de ces promoteurs ( Muskhelishvili et Travers , 2003 ) . Par exemple , en augmentant localement la superhélicité de l' ADN en amont des opérons d' ARNr , Fis favorise leur transcription qui nécessite une superhélicité forte , et ce même si la superhélicité globale du chromosome venait à diminuer . Ce n' est que lorsque la concentration de Fis diminue , lors du passage en phase stationnaire , que la transcription de ces opérons va diminuer . Enfin , Fis agit également sur le niveau de superhélicité de l' ADN de façon indirecte , en régulant les gènes codant les topoisomérases . En effet , Fis réprime l' expression des gènes codant la gyrase et active topA , qui code la TopoI , lors de stress oxydatifs . Fis est ainsi impliquée dans le contrôle homéostatique du degré de superhélicité de l' ADN ( voir paragraphe IV.B. ) . En effet , la transcription de fis est sensible au niveau de superhélicité . Tous ces mécanismes font de Fis une protéine centrale du contrôle de la superhélicité , agissant comme senseur des conditions de l' environnement , organisateur de la structure du chromosome et enfin régulateur des topoisomérases .. Structure de Fis La structure d' un monomère de Fis révèle 4 hélices & 206;& 177; entremêlées A à D ( Figure 15 A ) . Ces hélices s' étendent des résidus 27 à 42 ( A ) , 50 à 70 ( B ) , 74 à 81 ( C ) et 85 à 94 ( D ) . La structure formée par les 25 premiers acides aminés a longtemps été inconnue , et était donc supposée non structurée . Un mutant a été isolé , dont la structure a révélé une organisation en épingle à cheveux formée par deux feuillets & 206;& 178; et rattachés au corps de la protéine par des interactions hydrophobes et des liaisons hydrogène . Les hélices A et B sont localisées dans la partie N-terminale de la protéine et sont impliquées dans des interactions entre monomères pour construire une structure compacte dont la taille est d' environ 25 × 35 × 50 Å .. L' hélice A d' un monomère n' a aucun contact avec les hélices C' et D' de l' autre monomère , mais elle établit de nombreuses liaisons hydrogène et de Van der Waals avec l' hélice B'de l' autre monomère . L' hélice B est courbée en son milieu en direction de l' hélice C' avec laquelle elle forme une hélice virtuelle plus longue par l' intermédiaire de liaisons hydrogène ( Figure 15 A ) . Les hélices C et D sont situées dans la région C-terminale de la protéine et forment un motif hélice-tour-hélice de liaison à l' ADN . Les protéines contenant un tel motif s' insèrent généralement dans le grand sillon de l' ADN . L' orientation des groupements phosphate de l' ADN responsables des interactions avec Fis est telle que la distance entre deux grands sillons varie de 29 à 34 Å. Bien que les deux hélices D d' un dimère de Fis soient orientées correctement pour s' insérer dans les grands sillons , elles ne sont espacées que de 25 Å. La fixation de Fis résulte ainsi en une courbure de l' ADN ( Figure 11 C et 15B ) d' environ 50 à 90 ° . La régulation de Fis Le gène fis est le deuxième gène d' un opéron comportant également dusB , codant une dihydrouridine synthase . L' opéron dusB-fis est sous le contrôle d' un promoteur unique , fisP . Le nombre de molécules de Fis varie de façon importante au cours du cycle cellulaire . Il est maximal lors de l' entrée en phase exponentielle , environ 1h après dilution dans du milieu frais ( plus de 50 000 molécules ) , puis diminue jusqu'à une quasi-disparition de Fis en phase stationnaire ( moins de 100 molécules ) . Régulation transcriptionnelle Le promoteur fisP est reconnu par le facteur sigma végétatif & 207;& 131; 70 ( Figure 16 ) , même si la boîte - 35 est plus éloignée de la séquence consensus . Quatre caractéristiques de ce promoteur sont à l' origine d' une forte transcription en phase exponentielle , suivie d' un arrêt en phase stationnaire . Premièrement , ce promoteur se caractérise par la présence d' une séquence riche en GC entre la boîte - 10 et le site d' initiation de la transcription , appelée discriminateur ( Figure 16 ; Walker et al. , 1999 ) . Cette séquence crée une barrière énergétique pour l' ouverture de la double hélice lors de l' initiation de la transcription . Elle constitue la signature de gènes dont la transcription nécessite une superhélicité négative de l' ADN élevée . En effet , fis est activé par une superhélicité forte , caractéristique de la phase exponentielle de croissance ( voir paragraphe IV.A. ) . Ceci est à la base du contrôle homéostatique de la superhélicité de l' ADN par Fis . Deuxièmement , deux sites d' initiation de la transcription sont observés , dont le majeur est situé 8 pb après la boîte - 10 ( Figure 16 ) et fait intervenir un CTP comme nucléotide initiateur . Le second est situé 2 pb en amont et implique un GTP , mais ne participe que très faiblement à l' initiation de la transcription . Le fait d' initier la transcription par un CTP est un phénomène relativement rare chez E. coli , du fait de sa faible abondance , et de la faible interaction qu' il établit avec l' ARN polymérase ( Wu et Goldthwait , 1969 ) . Ceci en fait ainsi un remarquable mécanisme de régulation de la transcription pour des gènes qui sont transcrits rapidement puis réprimés tout aussi rapidement , ce qui est le cas de fis . En effet , à l' entrée en phase exponentielle de croissance , la concentration en CTP augmente , ce qui favorise une activation de la transcription de fis par la stabilisation du complexe ouvert . En milieu de phase exponentielle , la quantité de CTP disponible diminue fortement , et la transcription de fis aussi et , bien que cette diminution soit due à différents facteurs , elle suit la concentration en CTP de manière remarquable . Le remplacement de ce C par un A entraîne une prolongation de l' expression de fis jusqu'en phase stationnaire . Troisièmement , le promoteur de fis est soumis à une autorépression . En effet , Fis se fixe sur son propre promoteur , sur 6 sites répartis des résidus - 231 à + 30 ( Finkel et Johnson , 1992 ; . Fis présente une grande affinité pour les sites I et II , mais c' est surtout le site II qui participe à la répression . En effet , il chevauche la région - 35 du promoteur et , avec le site I , se superpose au site de fixation de l' ARN polymérase . L' hypothèse la plus probable est que la fixation de Fis empêche l' ARN polymérase d' initier la transcription . Quatrièmement , le promoteur de fis est soumis au contrôle stringent , c' est-à-dire à la répression par ( p ) ppGpp , l' effecteur de la réponse stringente permettant la réponse aux carences nutritionnelles . Les nucléotides ( p ) ppGpp sont synthétisés lors de carences nutritionnelles . Ils répriment alors les gènes nécessaires à la croissance et activent certains gènes nécessaires à la survie . Une des caractéristiques des promoteurs régulés négativement par la réponse stringente est la présence du discriminateur riche en GC entre la région - 10 et le + 1 de transcription . Le promoteur de fis est ainsi soumis à la répression par ( p ) ppGpp . Le contrôle stringent ainsi exercé sur fisP participe donc également à la chute de transcrits observée avant le passage en phase stationnaire . A côté des différents niveaux de régulation transcriptionnelle précédents , un autre régulateur est impliqué dans l' activation de l' opéron dusB-fis : IHF . Un site de fixation d' IHF est centré 114 pb en amont du + 1 de transcription du gène fis . La fixation d' IHF sur ce site entraîne une activation de la transcription de 3 ou 4 fois . Régulation traductionnelle La régulation de l' expression de fis s' exerce également au niveau de la traduction par une protéine à activité GTPase , appelée BipA , et qui présente des homologies avec des facteurs d' élongation de type EF-G . Son profil d' expression est similaire à celui de Fis : de très abondante en début de phase exponentielle , BipA devient quasiment indétectable après 3h de culture . BipA interagit avec les ribosomes et son rôle est de favoriser l' initiation de la traduction de l' ARNm de fis . En effet , des interactions particulièrement fortes existent entre la région 5 ' non traduite de l' ARNm de fis et les ribosomes , et BipA permettrait de déstabiliser ces interactions pour débuter l' initiation de la traduction par les ribosomes ( Figure 17 ; Owens et al. , 2004 ) . Les auteurs émettent deux hypothèses principales quant au rôle physiologique de BipA : la première est que l' interaction BipA-ribosomes permettrait de recruter ceux  -ci pour traduire fis , ce qui est indispensable en phase exponentielle , c' est-à-dire au moment où la traduction de nombreux ARNs est en cours . Ceci permettrait ainsi une synthèse préférentielle et rapide de Fis en début de phase exponentielle et une synthèse continue pendant la phase exponentielle . La seconde hypothèse est que l' activité GTPase de BipA aurait un rôle de senseur de la concentration en GTP , et ne permettrait la traduction de fis que lorsque la concentration est optimale , la traduction étant un phénomène particulièrement consommateur de GTP . Un second niveau de régulation de la traduction de Fis est réalisé par l' intermédiaire des polyamines ( putrescine , spermidine et spermine ) , la quantité de Fis augmentant en leur présence . Ces petites molécules interagissent avec les ARNs messagers et affectent ainsi la traduction des protéines . En déstabilisant les ARNm doubles brins , les polyamines rendent libre la séquence de Shine-Dalgarno , sur laquelle la sous-unité 30S du ribosome peut ensuite venir se fixer . Autres rôles de Fis dans la cellule En plus de son rôle dans le maintien d' un niveau optimal de superhélicité de l' ADN , Fis intervient dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux . Fis est en effet un régulateur de la transcription de nombreux gènes , mais est également impliquée dans la réplication du chromosome et dans des phénomènes de recombinaison et d' inversion site-spécifique . Régulateur global de l' expression des gènes Fis est connue pour réguler la transcription d' un grand nombre de gènes . Parmi ceux  -ci , Fis active la transcription des promoteurs d' ARN ribosomiques et d' ARN de transfert . Fis interagit avec 3 sites de fixation situés en amont du promoteur P1 de rrnB , mais c' est la fixation sur le site I qui est la plus importante pour l' activation du promoteur ( Figure 18 ) . En plus de modifications structurales de l' ADN ( voir plus haut ) , la fixation d' un dimère de Fis sur ce site permet son interaction avec la sous-unité & 206;& 177; de l' ARN polymérase ( Figure 19 ) , par l' intermédiaire des résidus situés à des positions comprises entre 68 et 74 d' un des monomères de Fis , c' est-à-dire situés à la connexion entre les hélices B et C ( Figure 15 ; . La présence de 3 sites de fixation de Fis consécutifs pourrait induire une plus grande torsion de l' ADN et ainsi un plus grand contact avec l' ARN polymérase . Fis est également un régulateur des gènes de topoisomérases , en inhibant la transcription des gènes gyrA et gyrB codant les sous-unités de la gyrase et en activant le gène topA codant la TopoI . Fis se lie au promoteur de gyrA , et la transcription est inhibée directement , Fis empêchant la fixation de l' ARN polymérase sur le promoteur . Pour gyrB , le mécanisme est moins clair : l' ARN polymérase se fixe sur le promoteur même en présence de Fis , mais une probable stabilisation de la structure empêcherait le début de la transcription . Fis intervient également dans le contrôle de différentes voies métaboliques en régulant , de façon indirecte cette fois , l' expression de gènes impliqués dans le catabolisme de sources de carbone ou d' acides nucléiques , comme glpK , ntlD , rbsB , cdd et udp . La recherche de gènes régulés par Fis a permis à Xu et Johnson ( Xu et Johnson , 1995b ) d' en identifier 13 autres , dont 5 seulement ont une fonction connue . Trois d' entre eux codent pour des protéines nécessaires à la croissance en milieu pauvre : des transporteurs du D-xylose ( XylF ) , de la glutamine ( GlnQ ) et des méthylgalactosides ( MglA ) . Les deux autres gènes identifiés codent SdhA , une sous-unité de la succinate déshydrogénase , et AldB , une aldéhyde déshydrogénase qui participe à la détoxification des alcools et aldéhydes ( Xu et Johnson , 1995a ) . D' autres gènes impliqués dans différentes voies métaboliques et réprimés par Fis ont été identifiés : acs , qui code l' acétyl-coenzyme A synthétase , qui permet à la cellule d' utiliser l' acétate lors de carences en sources de carbone et à l' entrée en phase stationnaire  ; l' opéron nir , codant une nitrite-réductase cytoplasmique intervenant en conditions d' anaérobiose  ; ou encore l' opéron nrf , actif lui aussi en anaérobiose et responsable de la réduction des nitrites par le formate . Sur un certain nombre de ces promoteurs , Fis agit de concert avec d' autres régulateurs de la transcription et assure ainsi une expression très fine et précise de ces gènes . De par les gènes qu' elle contrôle , notamment les opérons d' ARNr , la protéine de type histone Fis est donc un point de contrôle clef de la croissance bactérienne . Il a d' ailleurs été récemment démontré que Fis participait à la régulation du facteur & 207;& 131;S spécifique des conditions de stress nutritionnel , en réprimant la transcription de rpoS en phase exponentielle chez S. typhimurium ( Hirsch et Elliott , 2005 ) . Fis agirait ici par le même mécanisme que sur son propre promoteur , c' est-à-dire en empêchant la fixation de l' ARN polymérase à l' ADN . Enfin , Fis est également impliquée dans le contrôle de l' expression des gènes de virulence dans des souches pathogènes d' E. coli , chez S. flexneri et chez S. typhimurium . En effet , chez S. typhimurium , Fis active des gènes faisant partie des îlots de pathogénicité . La délétion de fis entraîne la diminution de l' expression de hilA et invF , associée à un déficit sérieux de virulence , chez la souris . Ces deux gènes sont responsables de l' activation de plusieurs opérons de SPI- 1 , un îlot de pathogénicité de S. typhimurium qui contient en partie le système de sécrétion de type III . De plus , la comparaison des profils globaux de transcription entre une souche de référence de S. typhimurium et un mutant dépourvu de Fis a révélé que Fis activait les gènes du système de sécrétion de type III , d' invasion des cellules épithéliales , de la survie dans les macrophages et de fabrication des flagelles , ces gènes étant répartis dans les îlots de pathogénicité SPI- 1 à 5 . Des gènes impliqués dans des voies métaboliques nécessaires à la survie dans l' intestin des mammifères sont régulés négativement par Fis ( utilisation du propanediol , biosynthèse de la biotine , transport de la vitamine B12 , métabolisme de l' acétate , ... ) . Ainsi Fis joue un rôle central en coordonnant l' expression de facteurs nécessaires à la croissance mais également à la virulence . La réplication Un autre rôle fondamental de Fis est celui joué dans l' initiation de la réplication . Fis possède en effet un ou plusieurs sites de fixation au niveau de l' origine de réplication oriC . Bien que la raison de cette fixation demeure inconnue , des mutants fis produisent une asynchronie de l' initiation de la réplication dans des conditions de croissance rapide . Une courbure induite par la fixation de Fis près d' oriC pourrait faciliter l' initiation de la réplication . Des interactions existent également au niveau d' oriC entre Fis , IHF et DnaA . Les phénomènes d' inversion et de recombinaison site-spécifique Fis a été découverte par sa capacité à favoriser les réactions d' inversion catalysées par les recombinases du type Hin , Gin et Cin ( Finkel et Johnson , 1992 ) . Durant ces réactions , Fis se lie à deux sites entourant une séquence de recombinaison ( Recombinational Enhancer ) d' environ 60 pb ( Figure 20 ) . D' autre part , la recombinase Hin se fixe au niveau des deux sites de recombinaison hixR et hixL et y est responsable du clivage et de la ligation des brins d' ADN . La fixation de Fis permet le rapprochement des deux sites hixR et hixL et du site stimulateur de la recombinaison . Ceci génère alors un intermédiaire de recombinaison au sein duquel duquel l' interaction entre Fis et la recombinase Hin induit l' événement de recombinaison , par extrusion sous forme de boucles de l' ADN situé entre hixR et hixL ( Figure 20 ; Osuna et al. , 1991 ) . On retrouve ainsi l' effet de la fixation de Fis sur l' ADN décrit précédemment . Enfin , Fis stimule également l' intégration et l' excision de l' ADN du bactériophage & 206;& 187; en se liant au site attR du génome phagique ( Ball et Johnson , 1991a , b ) . En introduisant une courbure dans l' ADN , Fis favorise l' intégration et l' excision de l' ADN du phage ( Esposito et Gerard , 2003 ) . Dynamique d' expression des NAPs Comme nous venons de le voir , Fis est la protéine de type histone majoritaire pendant la phase exponentielle . Son niveau augmente très rapidement au moment de la reprise de la croissance , pour atteindre plus de 50 000 molécules par cellule . Deux autres NAPs , HU ( 30   000 à 50   000 molécules ) et H-NS ( 20   000 molécules ) sont abondantes en phase exponentielle . En fin de phase exponentielle , leur niveau décroît , en même temps que le degré de superhélicité de l' ADN : Fis disparaît presque totalement alors que HU reste à un niveau basal correspondant à moins d' un tiers de sa concentration en phase exponentielle . H-NS subit une diminution de concentration d' environ deux fois , et reste ainsi présente en phase stationnaire . Lors de la transition entre les phases exponentielle et stationnaire , deux autres NAP deviennent majoritaires : Dps ( près de 200 000 molécules ) et IHF . Le rôle principal d' IHF se situe pendant cette transition , puisque son niveau atteint un pic ( 55 000 molécules ) , puis diminue par la suite , tout en restant à la moitié de son niveau maximal . Enfin , en phase stationnaire prolongée , la protéine Dps est de loin majoritaire . Une certaine hiérarchie entre ces protéines a donc été mise en évidence au cours du cycle cellulaire d' E. coli . L' expression de ces protéines de type histone est très dynamique tout au long de la croissance bactérienne . Ces protéines sont impliquées dans la régulation de la transcription de nombreux gènes , mais aussi dans les processus de réplication du chromosome et de recombinaison . Leurs différentes fonctions sont souvent réalisées de par leur effet sur la topologie de l' ADN . Ainsi , la dynamique d' expression de ces histones va conduire à des variations de superhélicité de l' ADN , locales ou globales , et ceci pourrait avoir un impact important sur les capacités de réponse des cellules aux fluctuations de leur environnement . De plus , comme nous allons le voir dans la partie suivante , les NAP sont également impliquées dans la structuration du chromosome en domaines plus ou moins larges et leur expression différentielle entraîne une plasticité importante de la structure du chromosome . Organisation du chromosome dans la cellule Chez les eucaryotes , les chromosomes sont organisés en plusieurs niveaux de compaction , l' unité de base étant la structure nucléosomique réalisée par les histones ( Kornberg et Lorch , 1999 ) . Le nucléosome est le point central du contrôle de la transcription . Chez les bactéries , une telle structuration est absente , mais l' ADN est aussi organisé au sein du nucléoïde par son association avec différentes protéines ( Pettijohn , 1996 ) . Une telle organisation est nécessaire pour compacter le chromosome de manière à le contenir dans la cellule ( compaction de 1000 fois pour le chromosome d' E. coli ) , mais aussi pour permettre la flexibilité nécessaire à la réplication du chromosome et à la transcription des gènes , processus qui vont par ailleurs être modifiés en fonction des conditions de l' environnement . Une partie de cette organisation repose sur le fait que le chromosome bactérien présente une superhélicité négative , qui facilite les transitions entre les conformations double et simple brin , nécessaires à tous les processus vitaux ( réplication , transcription , recombinaison ) . En revanche , le niveau global d' organisation du nucléoïde reste peu connu , bien que des travaux récents permettent de mettre en évidence la structuration spatiale du chromosome bactérien sous forme de domaines topologiques et de macrodomaines . Les domaines topologiques Le premier niveau de compaction du chromosome est sa division en domaines topologiques , un domaine étant défini comme la région relaxée par une coupure simple ou double brin de l' ADN ( Pettijohn , 1996 ) . En l' absence de domaines topologiques , une coupure aurait pour effet la rotation des brins d' ADN autour de cette coupure , conduisant à la perte rapide et catastrophique de la superhélicité négative , qui pourrait alors se propager à l' ensemble du chromosome et conduire ainsi à la mort cellulaire . De telles coupures peuvent en effet être générées in vivo par des altérations chimiques ( radicaux oxygénés , alkylation , dépurination ) , des endonucléases cellulaires , ou par le processus même de la réplication . Ainsi , la répartition de domaines topologiques tout au long du chromosome permet de préserver celui  -ci : suite à une coupure , seul un domaine sera relâché , et non le chromosome entier . Les changements de superhélicité seront ainsi restreints à un niveau local , grâce à la présence de barrières empêchant la diffusion des supertours entre différents domaines . Les premiers travaux effectués ont montré la nécessité de multiples coupures pour relâcher totalement le chromosome in vitro , ce qui suggérait la présence de différents domaines topologiques ( Worcel et Burgi , 1972 ) . Ces études , ainsi que d' autres basées sur l' utilisation de triméthylpsoralène tritié ( Sinden et Pettijohn , 1981 ) , ont conclu à l' existence d' une quarantaine de domaines , d' environ 100 kb chacun . Plus récemment , deux méthodes indépendantes ont été utilisées pour étudier plus finement l' organisation chromosomique en domaines topologiques . La première est basée sur l' identification de 306 gènes dont la transcription est modifiée suite à un relâchement de l' ADN , ces gènes étant dispersés sur le chromosome d' E. coli . Postow et al. ( 2004 ) se sont servis de cette étude pour déterminer l' impact d' une coupure du chromosome sur la transcription de ces 306 gènes . Des coupures doubles brins ont été introduites à des positions définies du chromosome par l' induction in vivo de l' expression de l' enzyme de restriction SwaI , qui présente 117 sites de coupures sur le chromosome d' E. coli . L' effet de ces coupures étant un relâchement de l' ADN , la transcription des gènes situés à proximité , notamment ceux sensibles à la superhélicité , va être affectée . Le profil global de transcription a donc été déterminé avant et après coupure par SwaI. Connaissant la distance entre les sites de restriction et les gènes sensibles au relâchement de l' ADN , les auteurs ont pu conclure à un nombre de domaines d' environ 450 , chacun ayant en moyenne une taille de 10 kb . Ces résultats ont été appuyés par une mesure directe de la taille des boucles chromosomiques formées par microscopie électronique . La deuxième étude porte sur des souches de S. typhimurium dans lesquelles des paires de sites res de recombinaison site-spécifique ont été introduites à différentes distances chromosomiques . Ces souches contiennent également les gènes , inductibles par l' IPTG , codant les résolvases des transposons Tn 3 ou & 206;& 179;& 206;& 180; . Un système de sélection permet de détecter et de quantifier les événements de recombinaison entre les sites res . Ce système de recombinaison site-spécifique est basé sur l' alignement précis de 2 sites res dont la taille est de 140 pb , et dépend d' un niveau adéquat de superhélicité négative ( Stark et Boocock , 1995 ) . Ainsi , 2 sites res ne peuvent recombiner qu' à l' intérieur d' un même domaine topologique , afin de permettre la diffusion de superhélicité négative entre les deux sites . L' utilisation de ce système ingénieux a révélé que la taille moyenne d' un domaine était d' environ 25 kb . Cette valeur , basée sur la stabilité des barrières entre domaines et sur celle de la résolvase Tn 3 ou & 206;& 179;& 206;& 180; utilisée , est probablement sur-estimée . En effet , la stabilité élevée de ces résolvases rend non détectables des domaines dont la durée de vie serait trop courte . Des mutants de la résolvase présentant des demi-vies variées ( de 5 min à plusieurs heures ) ont alors été utilisés pour étudier la dynamique du chromosome . Ces mutants ont permis de montrer que S. typhimurium , comme E. coli , possédait plus de 400 domaines topologiques par chromosome , de taille moyenne comprise entre 11 et 13 kb . D' autre part , ces domaines présentent une structure extrêmement dynamique , ce qui avait été montré précédemment . La dynamique de ces domaines est indispensable pour les processus de réplication et de transcription . En effet , ceux  -ci provoquent une forte altération du superenroulement et les domaines topologiques doivent se refermer rapidement après le passage de la fourche de réplication ou de l' ARN polymérase . Tous ces résultats impliquent non seulement la présence de barrières délimitant les différents domaines topologiques , mais également un grand dynamisme quant à leur localisation . Plusieurs hypothèses sont formulées quant à leur nature . La transcription Le processus de transcription de gènes codant des protéines membranaires pourrait générer des barrières à la diffusion des supertours . En effet , il a été démontré que la transcription de tels gènes provoquait une augmentation drastique de la superhélicité de l' ADN ( Lynch et Wang , 1993 ) . Le phénomène d' ancrage à la membrane cytoplasmique issu de la transcription / traduction de protéines membranaires pourrait ainsi contribuer à la formation de barrières topologiques . Ceci a été récemment confirmé en utilisant le système de recombinaison site-spécifique entre deux sites res . Ces deux sites , ainsi que le gène tetA codant une pompe à efflux membranaire pour la tétracycline , ont été introduits à l' intérieur d' un domaine topologique chez S. typhimurium . L' induction de la transcription de tetA engendre une réduction d' un facteur 20 de la recombinaison entre les deux sites res , ce qui suggère que la transcription d' un gène codant une protéine membranaire crée des barrières topologiques . Cependant , la transcription de gènes codant des protéines cytoplasmiques induit la même diminution de recombinaison entre sites res . Ainsi , le phénomène d' ancrage à la membrane n' est pas indispensable , et ce serait l' activité transcriptionnelle qui serait en elle-même responsable de la formation de domaines topologiques . Deng et al. ( 2004 ) suggèrent cependant qu' un niveau élevé de transcription serait nécessaire , et qu' une telle activité transcriptionnelle est rare dans la cellule . Ainsi , bien que la transcription contribue à la formation de barrières topologiques , elle ne peut expliquer à elle seule la présence de plus de 400 domaines topologiques . Les complexes SMC Dans les cellules eucaryotes , les protéines SMC ( Maintenance Structurale des Chromosomes ) assurent la structuration et l' organisation des chromosomes ( Heck , 1997 ) . Cette famille de protéines inclut les condensines ( ségrégation des chromosomes ) , et les cohésines ( alignement des chromatides soeur ) . Dans la cellule bactérienne , un seul complexe a été répertorié comme membre de la famille des protéines SMC : il a été appelé MukBEF chez E. coli , et BsSMC chez Bacillus subtilis ( Hirano et Hirano , 2006 ) . Les protéines SMC jouent un rôle dans le maintien du niveau de superhélicité de l' ADN . En effet , des mutants de ces gènes chez E. coli et B. subtilis présentent un changement de superhélicité de l' ADN plasmidique et chromosomique , ainsi qu' une décondensation du nucléoïde . Ces mutants montrent également une baisse de viabilité à des températures supérieures à 30 °C. De plus , certaines de ces mutations interfèrent avec les phénotypes conférés par d' autres mutations connues pour affecter le niveau de superenroulement dans les cellules . Par exemple , la sensibilité thermique de ces mutants est supprimée par des mutations du gène topA , codant la TopoI . Les protéines de type SMC sont actives sous forme de dimères dont la forme est celle d' un V , chaque sous-unité étant repliée et enroulée sur elle-même de manière anti-parallèle ( Hirano et Hirano , 2006 ) . Les extrémités de cette structure en V se regroupent et forment un site de liaison capable d' hydrolyser l' ATP après liaison à l' ADN . Dans le cas de MukB , le dimère est stabilisé par les co-facteurs MukE et MukF , qui permettraient la formation de polymères de complexes qui , en se liant à l' ADN , le compacteraient en structures de type « rosettes » ( Figure 21 ; Matoba et al. , 2005 ; Hirano et Hirano , 2006 ) . Cependant , le nombre total de molécules de MukB dans la cellule est de l' ordre de 150 , ce qui est bien trop faible pour être impliqué dans la formation de l' ensemble des 400 domaines topologiques . Comme dans le cas de la transcription , les complexes MukBEF ne peuvent contribuer qu' à la formation d' une partie des domaines topologiques . Les Topos L' utilisation du système de recombinaison site-spécifique entre deux sites res , décrit ci-dessus , a montré que le nombre de domaines topologiques augmentait dans certains mutants des gènes codant la gyrase .. Les Topos pourraient donc intervenir dans la mise en place de domaines topologiques . Plus récemment , Moulin et al. ( 2005 ) ont démontré la capacité de la gyrase à former des barrières en utilisant un autre système expérimental . Il s' agit d' une construction comportant d' une part un promoteur inductible fusionné au gène rapporteur uidA , codant la & 206;& 178;-glucuronidase ( GUS ) , suivi d' un terminateur fort de la transcription , et d' autre part le promoteur du gène gyrA , sensible à la superhélicité , et qui a été fusionné à lacZ , codant la & 206;& 178;-galactosidase ( Figure 22 ) . Selon le modèle de Liu et Wang ( 1987 ) , l' avancée de l' ARN polymérase sur l' ADN lors de la transcription provoque des supertours positifs en amont de la machinerie transcriptionnelle et des supertours négatifs en aval ( Figure 5 A ) . L' induction de la transcription de uidA va ainsi provoquer des supertours positifs qui pourraient se transmettre jusqu'au promoteur gyrA. Suite à l' induction de la transcription du gène uidA , Moulin et al. ( 2005 ) ont démontré un accroissement de l' activité & 206;& 178;-galactosidase , et donc de l' activité du promoteur gyrA sensible au niveau de superhélicité du chromosome . La diffusion de supertours positifs créés par la transcription de uidA , et donc l' induction du promoteur de gyrA , peut se faire à des distances d' environ 4 kb . Des séquences d' ADN connues pour contenir des sites de fixation de la gyrase ont alors été insérées entre le promoteur inductible et le promoteur de gyrA . Ces insertions entraînent une diminution de la transcription à partir du promoteur gyrA et empêchent donc la diffusion des supertours positifs générés par l' induction transcriptionnelle du gène uidA. Des sites de fixation de la gyrase peuvent donc faire office de barrières pour les domaines topologiques , et cette capacité est fortement corrélée à l' activité de coupure de l' ADN par l' enzyme . La gyrase est connue pour se fixer sur des sites spécifiques appelés SGS ( Strong Gyrase Site ) dans le cas du génome du bactériophage Mu , mais également présents sur des plasmides , à différentes positions sur le chromosome , et sur le génome d' autres bactériophages ( Morrison et Cozzarelli , 1979 ; Lockshon et Morris , 1985 ; Franco et Drlica , 1988 ) . D' autre part , la gyrase se fixe sur des séquences répétées présentes en plusieurs centaines de copies chez E. coli et S. typhimurium , nommées séquences REP ( Repetitive Extragenic Palindromic ) ( Yang et Ames , 1988 ) et BIME ( Interspersed Mosaic Elements ) . Le fait que la gyrase puisse constituer un type de barrières en se fixant sur ces sites rappelle la situation observée chez les eucaryotes , où la topoisomérase II est localisée à la base des boucles d' ADN ( Earnshaw et Heck , 1985 ) . Les protéines liées au nucléoïde Les protéines de type histone jouent un rôle majeur dans l' organisation du nucléoïde grâce à deux propriétés fondamentales : elles sont présentes en quantités abondantes dans les cellules bactériennes et se fixent à l' ADN de manière non spécifique . Même pour celles présentant une certaine spécificité de fixation , comme IHF ou Fis , les quantités présentes sont bien supérieures au nombre de sites de fixation à forte affinité , et elles vont donc également se fixer de manière aspécifique . Hardy et Cozzarelli ( 2005 ) ont tenté d' identifier les constituants des barrières topologiques en utilisant un crible génétique afin d' identifier des mutants de ces barrières chez E. coli . L' hypothèse de départ consiste à imaginer qu' un mutant de barrières topologiques va présenter un ADN globalement plus relâché que la souche sauvage . Une souche a été construite , contenant les gènes rapporteurs bla et lacZ , codant respectivement la & 206;& 178;-lactamase et la & 206;& 178;-galactosidase , chacun sous le contrôle du promoteur de gyrB , dont la transcription dépend du degré de superhélicité et augmente suite à un relâchement de l' ADN . Chacun des gènes rapporteurs a été intégré dans le chromosome de la souche rapporteur , les deux gènes étant insérés à deux loci différents ( Hardy et Cozzarelli , 2005 ) . Ainsi , la sélection sur les deux phénotypes simultanés , c' est-à-dire la résistance à l' ampicilline et une forte activité & 206;& 178;-galactosidase , permet de visualiser l' activation de la transcription du promoteur gyrB probablement due à un relâchement de l' ADN . Celui  -ci a lieu au niveau global du chromosome , plutôt qu' à un niveau local , car les deux gènes rapporteurs sont insérés à deux loci différents . Une mutagenèse par insertion utilisant le transposon mini-Tn 10 a été effectué , et les clones portant une insertion aléatoire du mini-Tn 10 ont alors été sélectionnés et criblés pour une fréquence de résistance à l' ampicilline accrue , ainsi que pour une production accrue de & 206;& 178;-galactosidase , par étalement sur un milieu contenant de l' ampicilline et du Xgal . Parmi les gènes identifiés par cette approche génétique , Hardy et Cozzarelli ( 2005 ) ont identifié hns , codant la protéine de type histone H-NS , qui constitue donc une barrière de domaines topologiques . Afin d' analyser de façon plus exhaustive le rôle potentiel des protéines de type histone , Hardy et Cozzarelli ( 2005 ) ont également utilisé une approche plus ciblée en délétant chacun des gènes d' histone dans leur souche rapporteur . Ceci leur a permis de montrer que Fis constituait également une barrière , ce qui n' était pas le cas d' IHF , de StpA ou de HU . Les protéines de type histone Fis et H-NS ont été particulièrement étudiées au niveau structural pour leur interaction avec l' ADN , sur lequel elles forment des boucles . Elles peuvent donc constituer des barrières de domaines topologiques . H-NS forme des oligomères et peut se fixer de façon coopérative sur plusieurs centaines de paires de bases . Ces auteurs ont montré par microscopie à force atomique que de telles structures ADN / H-NS pouvaient s' associer entre elles , provoquant ainsi non seulement la condensation de l' ADN , mais aussi une extrusion sous forme de boucles d' ADN libre ( Figure 23A ) . Par ailleurs , des mutants H-NS présentent une fréquence élevée de cellules anucléées .. Toutes ces données font d' H-NS une frontière idéale de domaines topologiques . Fis est capable de se lier à l' ADN sur une séquence spécifique , bien que dégénérée , mais également de façon non spécifique ( voir paragraphe I.B. 3 ) . In vitro , Fis se fixe préférentiellement à des points de croisements et de branchements sur l' ADN superenroulé , suggérant que Fis puisse , comme H-NS , contraindre des boucles d' ADN ( Figure 23B ) . Des mutants fis présentent des défauts de ségrégation des chromosomes et de division cellulaire à haute température . De plus , Fis est présente en quantités extrêmement importantes dans la cellule en phase exponentielle de croissance ( plus de 50 000 molécules par cellule ) , moment où le nombre de domaines topologiques est élevé , puis diminue fortement en phase stationnaire , avec le nombre de domaines . Les autres protéines La stratégie utilisée par Hardy et Cozzarelli ( 2005 ) leur a également permis de mettre en évidence 3 autres protéines pouvant contribuer à la formation des barrières topologiques . La première , codée par le gène pgm , est une phosphoglucomutase impliquée dans la glycolyse . Ce gène forme un opéron avec seqA , codant la protéine SeqA , qui se lie à l' ADN hémiméthylé et séquestre l' origine de réplication chez E. coli , assurant ainsi la coordination entre l' initiation de la réplication et le cycle cellulaire . SeqA est également impliquée dans la condensation du chromosome . Cependant , le rôle précis de Pgm et/ou de SeqA en tant que barrières topologiques n' est pas connu ( Hardy et Cozzarelli , 2005 ) . La deuxième protéine identifiée est DksA. Des mutants du gène dksA chez E. coli et S. flexneri présentent des cellules filamenteuses . Ces mutants révèlent également des interactions génétiques entre dksA et d' autres gènes , tels que dnaK , qui code un facteur de l' hôte nécessaire à la réplication de l' ADN du bactériophage & 206;& 187; ( Georgopoulos , 1977 ) , mukB , codant une protéine de type SMC ( voir paragraphe II.A.2 ) , ruv , impliqué dans les phénomènes de recombinaison ( West , 1997 ) , et recN , codant une protéine de type SMC induite par le système SOS . Les phénotypes des mutants dksA suggèrent ainsi un rôle dans la maintenance structurale du chromosome ( Hardy et Cozzarelli , 2005 ) . Ce rôle pourrait également être lié à l' activité de l' ARN polymérase , car DksA peut se fixer au niveau du canal secondaire de l' ARN polymérase où elle stabiliserait la fixation de ( p ) ppGpp , l' effecteur de la réponse stringente . La troisième protéine identifiée est TktA , la transcétolase majeure du métabolisme des sucres chez E. coli ( Josephson et Fraenkel , 1969 ) . Il s' agit de l' enzyme majeure du cycle des pentoses phosphate . Là aussi , son rôle dans les barrières topologiques reste mystérieux , mais tktA a été récemment identifié lors d' un criblage de mutants sensibles à la norfloxacine , un antibiotique ciblant les Topos de type II chez Bacteroides thetaiotaomicron ( Ueda et Yoshimura , 2003 ) . De plus , TktA est un homologue de RecP , une protéine impliquée dans les processus de recombinaison chez Streptococcus pneumoniae . TktA pourrait donc avoir une double fonctionnalité , dans le métabolisme des sucres et l' organisation du chromosome . En plus des protéines identifiées par l' étude de Hardy et Cozzarelli ( 2005 ) , les protéines intervenant dans la ségrégation du chromosome au cours de la division cellulaire pourraient également jouer un rôle de barrières de domaines topologiques . D' une part , FtsK coordonne la division cellulaire avec la ségrégation du chromosome . Elle est ancrée par son domaine N-terminal dans la membrane plasmique au niveau du septum par une interaction avec la protéine FtsZ , pendant que le domaine C-terminal aide à la translocation de l' ADN en dehors de l' espace du septum et facilite la décaténation . D' autre part , MreB est une protéine dont la structure est homologue à l' actine des eucaryotes et participe aussi au déplacement de l' ADN après la réplication ( Kruse et Gerdes , 2005 ) . Les macrodomaines L' organisation du chromosome en domaines topologiques ne reflète qu' un premier niveau de structuration , sous-jacent à un degré d' organisation impliquant de grandes distances chromosomiques bien supérieures à 10 kb . En particulier , des analyses d' hybridation in situ par fluorescence ( FISH ) chez E. coli ont révélé l' existence de 2 grandes régions d' environ 1 Mb chacune , appelées macrodomaines , l' une située autour de l' origine de réplication oriC et l' autre autour du terminus de réplication ter . Comme dans le cas des domaines topologiques , les macrodomaines ont une structure dynamique au cours du cycle cellulaire . Cette organisation en macrodomaines a été confirmée et précisée par une approche génétique , basée sur le système de recombinaison site-spécifique du bactériophage & 206;& 187; , afin de détecter la proximité spatiale de séquences d' ADN éloignées sur la structure primaire de la double hélice . Différentes souches ont été construites , comportant 2 sites d' attachement att du génome de & 206;& 187; , l' un à une position définie du chromosome et l' autre à des positions variées suivant les souches . Celles pour lesquelles un événement de recombinaison a eu lieu entre 2 sites att ont été sélectionnées . Les fréquences de recombinaison reflètent ainsi la capacité d' interactions et donc la proximité spatiale de séquences d' ADN . Valens et al. ( 2004 ) ont montré que les événements de recombinaison étaient fortement limités à certaines régions chromosomiques , ce qui a permis de révéler la présence de 4 macrodomaines sur le chromosome d' E. coli , séparés par deux régions moins structurées ( Figure 24 ) . Deux de ces macrodomaines entourant oriC et ter et d' environ 1 Mb chacun , correspondent à ceux déterminés précédemment par FISH . Cette organisation en macrodomaines permettrait d' une part la condensation de l' ADN conduisant à l' interaction entre séquences d' ADN à l' intérieur d' un même macrodomaine , et d' autre part la séquestration des macrodomaines , inhibant ainsi la recombinaison de séquences d' ADN localisées dans des macrodomaines différents . Cette organisation physique du chromosome en macrodomaines a des répercussions sur l' expression globale du génome . En effet , l' analyse du profil global de transcription des gènes chez E. coli en fonction de leur position sur le chromosome a permis de détecter une organisation spatiale de la transcription des gènes . La transcription globale a été analysée en présence et en absence de norfloxacine , un inhibiteur de la gyrase . Les profils de transcription obtenus ont été analysés sur la base de l' activité transcriptionnelle de chaque gène individuellement , mais également en fonction de similitudes régionales . Trois profils spatiaux de transcription ont été mis en évidence . Tout d' abord , dans un premier groupe de gènes , séparés par une distance allant jusqu'à 16 kb , la transcription est dépendante du niveau de superhélicité de l' ADN , c' est-à-dire du traitement à la norfloxacine . Les deux autres profils spatiaux de transcription correspondent à des régions plus grandes , d' une part de l' ordre de 100 kb , et d' autre part de 600 à 800 kb . La formation de ces deux derniers profils de transcription est quant à elle indépendante du degré de superhélicité du chromosome , mais semble être corrélée à la distribution des sites de fixation de la gyrase . De plus , Jeong et al. ( 2004 ) ont également montré que les profils de transcription sont plus importants au niveau du bras gauche de la fourche de réplication à partir d' oriC ( Figure 24 ) . La transcription de certains gènes proches de oriC et autour de ter est également sensible au niveau de superhélicité . Ainsi , l' organisation physique du chromosome en domaines topologiques et en macrodomaines a de fortes répercussions sur les profils spatiaux de transcription des gènes . De plus , les conditions de l' environnement vont influer sur ces deux fonctions cellulaires , structure du chromosome et transcription globale des gènes , qui sont donc non seulement intimement connectés , mais également dynamiques et modulables . Des expériences de microscopie en fluorescence , utilisant une fusion du gène rpoC , codant la sous-unité & 206;& 178;'de l' ARN polymérase , avec le gène gfp codant la protéine de fluorescence verte de méduse , ont permis d' étudier la distribution des molécules d' ARN polymérase dans la cellule et en particulier au niveau du nucléoïde et de sa périphérie ( Cabrera et Jin , 2003 ) . La distribution des molécules d' ARN polymérase est fortement dépendante des conditions de culture . En conditions de croissance rapide , l' ARN polymérase est concentrée au niveau de spots de fluorescence qui correspondent aux opérons d' ARNr . Cette forte activité transcriptionnelle semble d' ailleurs être corrélée à une condensation du chromosome ( Cabrera et Jin , 2003 ) . Tout traitement inhibant la transcription des ARNr , par exemple l' induction de la réponse stringente par une carence en acides aminés , fait d' une part disparaître les spots de fluorescence et d' autre part diminuer la condensation du chromosome . Ainsi , non seulement l' activité transcriptionnelle a une influence sur la structuration du chromosome ( voir paragraphe II.A. 1 ) , mais la structure du chromosome , ainsi que les quantités des différentes NAPs , influent sur la transcription et sont modifiées au cours du cycle cellulaire chez E. coli ( Figure 25 ) et dans différentes conditions de l' environnement , par exemple les carences nutritionnelles ( voir paragraphe IV.A. ) . Le passage de la phase exponentielle à la phase stationnaire est caractérisé par une restructuration complète du chromosome bactérien , aboutissant tout d' abord à des structures toroïdales puis à des structures cristallines au sein desquelles desquelles l' ADN est séquestré et protégé . La structure du nucléoïde est donc dynamique et varie en fonction des conditions de l' environnement , qui en retour conduisent à des fluctuations des profils d' expression du génome . Ces deux processus pourraient être associés afin de permettre une réponse adéquate des bactéries aux fluctuations de leur environnement . Impact de la superhélicité de l' ADN sur l' expression des gènes Les fluctuations du niveau de superhélicité de l' ADN ont des conséquences importantes sur l' expression de nombreux gènes , dont la transcription des opérons d' ARN ribosomiques ( Muskhelishvili et Travers , 2003 ) . Une superhélicité négative est en effet requise pour leur transcription . Ainsi , ne serait -ce que par son effet sur la synthèse des ARNr , le niveau de superhélicité de l' ADN doit être régulé de façon précise pour l' adaptation des bactéries à des conditions de croissance ou de carences . D' autre part , une augmentation de la superhélicité négative du chromosome provoquée par une mutation du gène topA entraîne une modification de l' expression des gènes , observée par électrophorèse bidimensionnelle de protéines . Des effets similaires sont obtenus suite à une mutation du gène hupA , codant la sous-unité & 206;& 177; de HU , qui provoque une compaction du chromosome . De façon générale , des mutations affectant les gènes codant les NAPs ( H-NS , Fis , HU , IHF ) ont des effets drastiques sur la transcription globale des gènes . Des modifications de superhélicité de l' ADN provoquent également de profonds changements d' expression chez d' autres bactéries , comme par exemple chez Haemophilus influenzae , ou même chez la levure Saccharomyces cerevisiae . Plus récemment , la comparaison des profils de transcription globale d' une souche d' E. coli dont le chromosome présente un défaut de superhélicité ( inactivation des gènes codant la gyrase ) avec une souche de référence , ou de cette souche de référence cultivée en présence ou en absence d' inhibiteurs de la gyrase , révèle que l' expression de 7 % des gènes du chromosome est affectée par le niveau de superhélicité . La relaxation du chromosome provoque l' activation de la transcription de 106 gènes et l' inhibition de celle de 200 gènes . Les gènes dont la transcription est modifiée remplissent des fonctions diverses et sont dispersés sur le chromosome . Les gènes induits présentent des séquences riches en AT à la fois aux niveaux des promoteurs et des régions codantes , ce qui n' est pas le cas des gènes dont l' expression est réprimée dans ces conditions . Une superhélicité négative élevée réprimerait l' échappement de l' ARN polymérase au niveau de promoteurs riches en AT ainsi que l' élongation de la transcription . A l' opposé , une superhélicité négative élevée est connue pour favoriser l' initiation de la transcription au niveau de promoteurs possédant une séquence discriminatrice riche en GC entre la boîte - 10 et le site + 1 d' initiation de la transcription . Un discriminateur est présent au niveau des promoteurs des opérons d' ARNs ribosomiques , ce qui explique la nécessité d' un superenroulement négatif élevé pour leur transcription . Celui  -ci permettrait de lever la barrière énergétique posée par le discriminateur riche en GC . Un discriminateur est présent pour tous les promoteurs connus pour être réprimés par ( p ) ppGpp , l' effecteur de la réponse stringente . Ainsi , la plupart des gènes exprimés dans les conditions optimales de croissance nécessitent une superhélicité négative élevée . La superhélicité de l' ADN est donc intimement liée à l' expression des gènes et pourrait représenter un élément régulateur majeur de l' adaptation des bactéries à leur environnement , en ajustant la transcription globale des gènes aux variations de l' environnement ( Figure 25 ) . Cependant , malgré une organisation dynamique de la structure de l' ADN , sa superhélicité doit être contrôlée de façon précise pour éviter des modifications trop importantes qui auraient des conséquences létales pour la cellule . Ceci est réalisé par l' intermédiaire d' un contrôle homéostatique du niveau de superhélicité de l' ADN . Régulation et contrôle homéostatique du niveau de superhélicité de l' ADN La régulation de la superhélicité de l' ADN est finement contrôlée à plusieurs niveaux . Le premier est une régulation croisée des gènes de Topos en fonction du degré de superhélicité de l' ADN . L' expression et l' activité de la gyrase sont en effet inhibées par un superenroulement de l' ADN trop élevé ( Menzel et Gellert , 1983 ) . A l' opposé , les promoteurs des gènes gyrA et gyrB sont activés en cas de relâchement de l' ADN ( Franco et Drlica , 1989 ) . Le promoteur gyrA est d' ailleurs utilisé comme senseur de la topologie de l' ADN . Le mécanisme par lequel ce promoteur est activé par un relâchement de l' ADN reste inconnu , mais la boîte - 10 du promoteur serait impliquée . La formation du complexe ouvert lors de l' initiation de la transcription de gyrA et gyrB pourrait également constituer une étape sur laquelle le relâchement de l' ADN agirait comme activateur ( Menzel et Gellert , 1987 ) . Contrairement à la gyrase qui est activée par une diminution de la superhélicité de l' ADN , la TopoI est elle activée par une augmentation du niveau de superhélicité . L' état de superenroulement du chromosome établit ainsi une boucle d' autorégulation des Topos dans la cellule , permettant le maintien d' un niveau adéquat de superhélicité . Les fluctuations de l' environnement influencent fortement le niveau de superhélicité du chromosome bactérien , comme par exemple les carences nutritionnelles ( Balke et Gralla , 1987 ) , les stress osmotiques ( Higgins et al. , 1988 ) , oxydatifs , thermiques et de pH . La seule autorégulation des Topos sur elles-mêmes ne peut pas expliquer les variations de superhélicité observées en fonction des conditions environnementales . Des niveaux supplémentaires de régulation du degré de superhélicité , et donc des gènes codant les Topos , doivent donc exister pour détecter et répondre aux signaux de l' environnement . Contrôle homéostatique de la superhélicité de l' ADN en fonction des conditions environnementales Le mécanisme moléculaire par lequel le niveau de superhélicité de l' ADN varie en fonction des conditions de l' environnement , tout en étant maintenu à des niveaux physiologiques adéquats , est le mieux décrit dans le cas des transitions entre apports de nutriments et carences nutritionnelles , et vice versa . En coordination avec certains facteurs de transcription , c' est la protéine de type histone Fis ( voir paragraphe I.B. 3 ) qui joue le rôle majeur dans cette régulation , qui consiste en un contrôle homéostatique de la superhélicité de l' ADN ( Figure 26 ) . En effet , Fis exerce un contrôle transcriptionnel sur les gènes de Topos et en retour , le niveau de superhélicité de l' ADN régule la transcription du gène fis . Lors d' un apport de nutriments , c' est-à-dire en début de phase exponentielle de croissance , l' activité de la gyrase augmente suite à l' accroissement de la charge énergétique cellulaire , en l' occurrence du rapport [ ATP ] / [ ADP ] . Il s' ensuit une augmentation du niveau de superhélicité négative de l' ADN ( Balke et Gralla , 1987 ) , qui active alors la transcription de fis . La protéine Fis atteint sa concentration maximale lors de la phase de croissance exponentielle . Cette augmentation de la superhélicité de l' ADN et de Fis est alors favorable à la transcription des gènes nécessaires à la croissance bactérienne , dont les opérons d' ARN ribosomiques . En parallèle , Fis va également réprimer la transcription des gènes gyrA et gyrB , ce qui va entraîner en fin de phase exponentielle une diminution de la superhélicité de l' ADN . La transcription de fis nécessitant une superhélicité élevée , ce relâchement de l' ADN entraîne la diminution de la transcription de fis . A ce moment , lors du passage en phase stationnaire , il y a également induction de la réponse stringente et donc de la synthèse de ( p ) ppGpp , qui va inhiber la transcription de fis . Tous ces mécanismes conduisent à une forte diminution de la transcription des opérons d' ARNr . La forte diminution de concentration de Fis va alors lever l' inhibition sur la transcription des gènes gyrA et gyrB. Malgré cela , un relâchement de l' ADN est observé lors du passage en phase stationnaire , et cela s' explique en partie par l' accumulation de & 207;& 131;S ( Hengge-Aronis , 2002 ) . En effet , parmi les nombreux gènes-cibles de & 207;& 131;S , se trouvent gyrI , codant un inhibiteur de la gyrase , et topA , dont un des promoteurs est & 207;& 131;S-dépendant . Une interaction directe de la gyrase avec GyrI a été montrée , et ceci a été confirmé par l' étude du mécanisme d' action de cet inhibiteur , qui séquestrerait la gyrase probablement en empêchant son interaction avec l' ADN ( Chatterji et Nagaraja , 2002 ) . D' autre part , la diminution de la quantité de nutriments dans le milieu va empêcher l' activité de la gyrase , sensible au rapport [ ATP ] / [ ADP ] . Ainsi , malgré la transcription des gènes codant la gyrase suite à la levée de la répression par Fis , le degré de superhélicité de l' ADN diminue en phase stationnaire . Le relâchement de l' ADN en phase stationnaire est alors favorable à la transcription des gènes & 207;& 131;S-dépendants . En effet , même en phase stationnaire , & 207;& 131;S ne représente que 30 % de la quantité du facteur sigma végétatif & 207;& 131; 70 , et un des principaux facteurs discriminants pour la transcription des gènes entre & 207;& 131; 70 et & 207;& 131;S est le degré de superhélicité du promoteur . La diminution de superhélicité permet ainsi d' activer les gènes essentiels à la survie en phase stationnaire , et permet donc l' adaptation des bactéries aux conditions de carences . Bien que l' activité de la gyrase soit diminuée en phase stationnaire , sa quantité reste constante . Lors d' un apport en nutriments , ceci permet probablement une augmentation immédiate du niveau de superenroulement de l' ADN suite à l' augmentation de la charge énergétique , et donc une reprise de la croissance cellulaire . La protéine Fis va être à nouveau synthétisée et jouer son rôle majeur sur le contrôle homéostatique de la superhélicité de l' ADN et sur la croissance cellulaire . Fis est donc un régulateur essentiel de la croissance bactérienne en fonction des conditions nutritionnelles de l' environnement . Autres stress environnementaux et topologie de l' ADN Le niveau de superhélicité de l' ADN est aussi modifié suite à différents stress , tels que les stress osmotique ou oxydatif . Cette modification est transitoire et associée à des changements , eux aussi temporaires , de l' expression des gènes . Ceci permet ainsi la synthèse de protéines nécessaires à la survie de la cellule . Quand les conditions de stress disparaissent , le niveau de superenroulement de l' ADN revient à celui d' origine , comme les profils de transcription des gènes . Lors de stress oxydatifs , c' est à nouveau la protéine Fis qui intervient dans le contrôle de la superhélicité et de l' expression des gènes nécessaires à la survie dans ces conditions . Un stress oxydatif a pour effet de diminuer la superhélicité de l' ADN . Ceci est réalisé par l' induction du gène topA , codant la TopoI. La protéine de type histone Fis a été démontrée comme étant indispensable à la survie au stress oxydatif , car Fis active topA dans ces conditions . Un mutant dépourvu de Fis est en effet sensible au stress oxydatif . De plus , un tel stress induit la synthèse de polyamines ( Tkachenko et Nesterova , 2003 ) , connues pour activer la traduction de Fis . La diminution de superhélicité , liée à l' activation de topA par Fis , entraîne alors l' induction des gènes nécessaires à la réparation des dommages de l' ADN suite au stress oxydatif et à la détoxification des espèces réactives de l' oxygène , permettant ainsi d' éliminer le stress . Ensuite , la superhélicité augmente à nouveau suite à la diminution de transcription de topA et les gènes nécessaires à la survie ne sont plus transcrits . Fis est donc un régulateur global de l' expression des gènes , qui permet l' adaptation des bactéries à leur environnement via un contrôle du degré de superhélicité de l' ADN . En plus du stress oxydatif , la transcription du gène topA est capable de répondre à d' autres stress grâce à la présence de 4 promoteurs , qui sont activés dans des conditions différentes : P1 est activé par un choc à haute température par l' intermédiaire de & 207;& 131; 32 , le facteur sigma induit au cours de chocs thermiques ; P2 et P4 sont les promoteurs majoritaires au cours de la phase exponentielle à 37 °C et 30 °C  ; P5 ( ou PX1 ) est induit en phase stationnaire par l' intermédiaire de & 207;& 131;S , le facteur sigma spécifique de la phase stationnaire et d' autres stress chez E. coli . Ces multiples promoteurs permettraient la synthèse de novo de TopoI en cas de changement de conditions de croissance , et donc un changement rapide du niveau de superhélicité . Lors d' un choc osmotique , le superenroulement de l' ADN augmente , à la suite de l' augmentation du rapport [ ATP ] / [ ADP ] dans la cellule , qui stimule l' activité de la gyrase . Ceci active la transcription des gènes impliqués dans la réponse à ce stress , notamment des gènes codant des osmorégulateurs ou impliqués dans la synthèse du peptidoglycane . Le gène proU par exemple , codant un système de transport d' osmoprotecteurs tels que la glycine-bétaïne , est fortement induit . Une mutation dans le gène topA , par l' augmentation de superhélicité qu' elle induit , peut mimer l' effet d' un stress osmotique et induire l' expression de proU. Après un stress osmotique , la superhélicité revient à son niveau d' origine , ainsi que l' expression de proU et des autres gènes . D' autres stress ( pH , thermique ) influent également de façon transitoire sur le niveau de superhélicité de l' ADN . Comme les deux cas décrits ci-dessus , ces changements de superhélicité sont transitoires et vont également influer de façon temporaire sur la transcription des gènes nécessaires à la survie à ces stress , ce qui permet aux bactéries de s' adapter à ces conditions de l' environnement . La superhélicité de l' ADN représente donc un point de contrôle clef de l' adaptation des bactéries aux transitions nutritionnelles et aux stress environnementaux . Les fluctuations de l' environnement entraînent des modifications du niveau de superenroulement de l' ADN , qui en retour provoquent des changements dans les profils globaux de transcription des gènes . Ceci permet ainsi l' adaptation des bactéries à leur environnement . Un contrôle homéostatique du niveau de superenroulement permet également son maintien à un niveau physiologique , nécessaire au bon fonctionnement de tous les processus vitaux pour la cellule . Toutes ces propriétés font de la superhélicité de l' ADN un réseau de régulation global de l' expression des gènes , indispensable à la détection de signaux de l' environnement et à la transmission de ces signaux à la machinerie cellulaire . Ce réseau pourrait donc constituer une cible de la sélection naturelle et donc des processus évolutifs . Introduction Partie II La Stratégie d' Evolution Expérimentale L' évolution fait depuis longtemps l' objet de recherches dont le but est d' en comprendre les mécanismes . Cependant , il est difficile d' appréhender les différentes étapes et les modifications qui amènent un organisme à s' adapter à son environnement . Les nombreuses études comparatives menées ( Losos et al. , 1998 ; Rundle et al. , 2000 ; Derome et al. , 2006 ) présentent en effet deux inconvénients majeurs : les fluctuations de l' environnement et l' absence de dénominateur commun , c' est-à-dire la non-connaissance de l' organisme ancêtre . Ainsi , l' évolution darwinienne , c' est-à-dire la diversification des organismes suivie de la sélection des individus les plus adaptés à leur environnement , est soumise à deux contraintes qui rendent son étude difficile : l' environnement et l' histoire évolutive passée . C' est pourquoi des stratégies d' évolution expérimentale ont vu le jour au cours des dernières décennies . Ces stratégies utilisent pour la plupart des microorganismes ( virus , bactéries ou levures ) , qui présentent différents avantages : temps de génération court , culture aisée ( par rapport à des organismes plus complexes ) , et présence de plusieurs réplicats pour chaque expérience . Un certain nombre de stratégies d' évolution expérimentale ont utilisé des bactériophages ( Bull et al. , 1997 ) . Cependant , ce sont des organismes beaucoup moins complexes que les bactéries , ne présentant par exemple pas de réseaux complexes de régulation des gènes . La bactérie E. coli a été très souvent utilisée dans de telles expériences d' évolution . Plusieurs conditions de croissance ont été étudiées , et notamment une adaptation à de longues périodes de carence . Les bactéries s' adaptent par des modifications du gène rpoS , codant le facteur sigma de la phase stationnaire ( Zinser et Kolter , 2000 ) , mais également en augmentant leurs capacités à utiliser les acides aminés comme sources de carbone ( Zinser et Kolter , 1999 ) . Le second type d' évolution expérimentale est une adaptation à une croissance continue en chémostat , dans laquelle les bactéries sont maintenues dans un état physiologique constant . Des modifications parallèles conduisant à un transport amélioré du glucose à travers la membrane ont été détectées dans des populations indépendantes ( Ferenci , 2001 ) . Enfin , le dernier type d' évolution expérimentale est celui initié par Richard Lenski , et qui consiste à adapter les bactéries à des transitions quotidiennes entre phase de croissance et carences nutritionnelles . Cette expérience possède plusieurs particularités : c' est tout d' abord la plus longue qui ait été effectuée à ce jour , puisqu' elle n' a quasiment pas été interrompue pendant 18 ans . Ensuite , tous les intermédiaires d' évolution ont été conservés et peuvent donc être « ressuscités » à tout moment . Enfin , les nombreux travaux effectués à partir de cette stratégie en font une des mieux caractérisées , jusqu'à présent . Cette stratégie d' évolution expérimentale , utilisée dans ce travail , fait l' objet d' une revue intitulée « Global regulatory networks plasticity during experimental evolution in E. coli » , qui sera soumise à la revue BioEssays ( Philippe N. , Crozat E. , Lenski RE. , and Schneider D. ) . Une présentation d' ensemble de cette stratégie d' évolution expérimentale est donnée ici . Le système d' évolution expérimentale a été initié dans le laboratoire du Pr . Richard Lenski ( Michigan State University , USA ) en 1988 . Un clone ancêtre d' E. coli B , de phénotype Ara- , c' est-à-dire incapable d' utiliser l' arabinose comme source de carbone , ainsi qu' un variant isogénique de phénotype Ara + , ont été utilisés pour initier 12 populations indépendantes , 6 étant issues de l' ancêtre Ara- ( appelées Ara- 1 à Ara- 6 ) et 6 de l' ancêtre Ara + ( appelées Ara + 1 à Ara + 6 ) . Le phénotype d' utilisation de l' arabinose est utilisé comme marqueur dans les expériences de compétition et a été démontré comme étant neutre dans ces conditions . Toutes ces populations sont propagées pendant 24h à 37 °C , sous agitation , dans 10 mL de milieu minimum Davis ( DM ) contenant une quantité limitée de glucose ( 25 µg / mL , DM25 ) . Chaque jour , elles sont diluées au 1 / 100ème dans le même milieu . Cette dilution permet environ 6 , 64 générations par 24h ( log 2 100 ) , et une concentration d' environ 5.107 cellules / mL est obtenue après 24h de culture . Depuis 1988 , les 12 populations ont donc évolué pendant plus de 40 000 générations dans ce milieu constant , de façon indépendante à partir d' un ancêtre commun , ce qui , à l' échelle humaine , correspondrait environ à un million d' années . Chaque jour , ces populations rencontrent d' abord une phase de latence , une phase exponentielle , puis elles entrent en phase stationnaire jusqu'au jour suivant , où les cellules recommencent à croître dans le milieu frais . Ces populations sont donc propagées dans des conditions où elles alternent tous les jours entre des conditions de croissance et de carences nutritionnelles , et vice versa . Outre les nombreux avantages liés à E. coli ( multiplication rapide et clonale , grande taille de populations , données disponibles très nombreuses ) , ce système d' évolution expérimentale présente un certain nombre d' atouts : des échantillons des 12 populations ont été prélevés et congelés toutes les 500 générations , permettant ainsi d' isoler des individus évolués à chacun des temps d' évolution et dans chacune des 12 populations . N' importe quel clone évolué peut donc être comparé à son clone ancêtre , par exemple par des expériences de compétitions , mais aussi pour tout paramètre phénotypique ou moléculaire . les mutations identifiées au cours de cette évolution expérimentale peuvent être introduites par recombinaison homologue dans le chromosome de l' ancêtre et de tout clone évolué , au moyen de plasmides suicides , et leurs effets peuvent être analysés dans différents contextes génétiques et environnementaux . Le stade d' apparition et de fixation de chaque mutation peut aussi être déterminé . Les expériences de compétition consistent , après 24h d' adaptation de chaque compétiteur au milieu étudié , à mélanger un clone évolué et le clone ancêtre de marqueur Ara opposé ( Figure 27 ) . Au temps zéro , c' est-à-dire à l' instant du mélange , un premier prélèvement est effectué et une dilution adéquate est étalée sur un milieu solide contenant du tétrazolium et de l' arabinose . Sur ce milieu , les colonies Ara + apparaissent roses alors que les Ara- apparaissent rouges , ce qui permet de les distinguer et de les dénombrer . Après 24h de co-culture , un nouvel échantillon est prélevé , dilué puis étalé , et les deux compétiteurs sont à nouveau dénombrés . Les proportions des 2 compétiteurs déterminées au début et à la fin de la co-culture permettent de calculer le fitness : c' est le ratio des taux de croissance de ces deux compétiteurs ( Figure 27 ) . La trajectoire d' évolution du fitness de chacune des 12 populations a été déterminée au cours du temps , par rapport au clone ancêtre . Le fitness augmente de 70 % en moyenne après 20 000 générations d' évolution ( Lenski et Travisano , 1994 ; Cooper et Lenski , 2000 ) , avec une augmentation très forte pendant les 2000 premières générations , puis plus lente par la suite ( voir figure 1 de l' article suivant ) . Cette augmentation de fitness est similaire au sein des 12 populations , ce qui révèle une évolution phénotypique parallèle , caractéristique de l' adaptation des bactéries à ces conditions expérimentales . D' autres phénotypes ont été identifiés sur la base de leur évolution parallèle dans la majorité des 12 populations . Le phénotype le plus visible est une modification de la morphologie cellulaire , associée à une augmentation de la taille et du volume cellulaire , de 50 à 100 % , qui suit de manière similaire l' augmentation du fitness ( Mongold et Lenski , 1996 ) . Les paramètres de la croissance et les capacités cataboliques des cellules sont également affectés de manière parallèle au cours de l' évolution .. En effet , chacune des 12 populations évoluées révèle une forte augmentation du taux de croissance , ainsi qu' une diminution du temps de latence . D' autre part , la croissance prolongée de ces populations avec du glucose comme seule source de carbone a conduit à une diminution de 42 % en moyenne de la capacité de croissance sur une grande diversité de substrats ( Cooper et Lenski , 2000 ) . Sur 64 substrats testés , les clones évolués de la majorité des 12 populations présentent une capacité réduite à utiliser 16 sources de carbone après 10 000 générations ( Cooper et Lenski , 2000 ) . Cette diminution touche vraisemblablement des fonctions non indispensables dans l' environnement de l' évolution où le glucose est la seule source de carbone . L' adaptation des bactéries se caractérise ainsi par un phénomène de spécialisation écologique . Dans un cas extrême , une perte de fonction a été observée pour les 12 populations : la capacité à utiliser le ribose comme source de carbone . Ceci est dû à des délétions de l' opéron rbs d' utilisation du ribose , associées à l' activité d' une séquence d' insertion IS150 . Des modifications parallèles de phénotypes au cours de l' évolution représentent une signature de la sélection naturelle , ces changements phénotypiques pouvant alors représenter des modifications bénéfiques dans ces conditions . Il a ainsi été démontré que les délétions de l' opéron ribose étaient effectivement bénéfiques dans ces conditions d' évolution expérimentale , procurant un effet positif d' environ 2 % sur le fitness . D' autre part , le taux de mutation est un autre caractère présentant des changements parallèles au cours de cette évolution expérimentale . En effet , 4 des 12 populations présentent un taux de mutation environ 100 fois plus élevé que celui de l' ancêtre , suite à des mutations dans les gènes codant les protéines impliquées dans le système de réparation des mésappariements de l' ADN . Les mutations responsables de l' adaptation des bactéries à leur environnement , et pouvant conférer un fitness accru dans ces conditions , ont été recherchées par 2 types d' approches : l' utilisation de marqueurs génomiques et l' analyse moléculaire de phénotypes modifiés de façon parallèle dans la majorité des 12 populations au cours de l' évolution . Une analyse de l' évolution des génomes a été effectuée par polymorphisme de longueur de fragments de restriction ( RFLP ) , en utilisant les séquences d' insertion IS connues chez E. coli comme marqueurs génomiques au sein de deux populations appelées Ara- 1 et Ara + 1 . Une vingtaine de clones évolués ont été isolés , dans chacune des deux populations , à différents temps d' évolution , et leur ADN génomique a été hybridé avec les 7 séquences IS présentes chez E. coli B utilisées comme sondes moléculaires . Leurs profils d' hybridation ont été comparés à celui du clone ancêtre et des arbres phylogénétiques ont été construits . Ceux  -ci ont permis la mise en évidence de mutations , détectées de façon précoce pendant les 2000 premières générations , période où l' augmentation de fitness est la plus forte . Ces mutations sont conservées chez tous les descendants dans chacune des deux populations . Elles mettent donc en valeur des gènes qui constituent de bons candidats pour la recherche des mutations bénéfiques et qui ont été caractérisés par la détermination des sites d' insertion des IS correspondantes . En plus des délétions de l' opéron ribose ( voir plus haut ) , 4 autres mutations correspondant à des transpositions d' IS ont été mises en évidence . Elles affectent les gènes pykF ( codant la pyruvate kinaseI ) , nadR ( codant un régulateur du métabolisme du Nicotinamide Adénine Di-nucléotide ) ( Tritz et Chandler , 1973 ) , hokB-sokB ( un locus homologue des systèmes de maintien de plasmides ) ( Pedersen et Gerdes , 1999 ) , et pbpA-rodA ( codant les protéines BP2 et RodA impliquées dans la biosynthèse de la paroi ) . Les loci nadR ( Ara + 1 ) , pykF ( Ara- 1 ) et hokB-sokB ( Ara + 1 ) sont mutés par des transpositions d' IS 150 à l' intérieur des séquences codantes , aboutissant probablement à l' inactivation de ces gènes . L' opéron pbpA-rodA est muté par l' insertion d' une copie d' IS 150 11 pb en amont du promoteur , provoquant une dérégulation de l' expression de ces gènes ( Philippe , 2006 ) . Le séquençage de ces 4 gènes dans les 12 populations à 20 000 générations a révélé un fort degré de parallélisme génétique : en effet , des mutations ont été détectées dans les gènes pykF et nadR dans toutes les populations , et dans les gènes pbpA-rodA et hokB-sokB dans la moitié des populations . Ces résultats ont été comparés aux séquences obtenues pour 36 gènes choisis au hasard chez des clones évolués isolés à 20 000 générations de chacune des 12 populations d' évolution expérimentale . Seulement 6 mutations ont alors été détectées dans ces 36 gènes , et uniquement dans les populations mutatrices , présentant un taux de mutation 100 fois supérieur à celui de l' ancêtre . De plus , chacune des 6 mutations n' a été observée que dans une seule population . Le fort parallélisme génétique observé pour les 4 loci nadR , pykF , pbpA-rodA et hokB-sokB contraste donc de façon importante avec la quasi-absence de mutations mise en évidence pour le groupe de 36 gènes choisis aléatoirement . Ceci suggère que les 4 loci sont soumis à la sélection naturelle et que les mutations correspondantes pourraient conférer un avantage sélectif au cours de l' évolution expérimentale . La seconde stratégie d' identification de mutations bénéfiques a consisté à mesurer et comparer , par rapport à celui du clone ancêtre , les profils globaux d' expression des gènes de deux clones évolués indépendants , isolés à 20 000 générations des populations Ara- 1 et Ara + 1 . Ces analyses globales d' expression ont été réalisées par détermination des profils globaux de transcription et protéiques . Les deux types d' analyses ont révélé un fort degré de parallélisme , car un nombre important de gènes et de protéines subissent des changements d' expression similaires , allant dans la même direction par rapport au clone ancêtre , et ce dans les deux clones évolués indépendants . En effet , dans ces deux clones évolués , les profils transcriptionnels révèlent la modification parallèle de la transcription de 59 gènes , tandis que les profils protéiques montrent une modification parallèle de 38 protéines , sur 300 à 400 visualisées . Conformément à l' hypothèse nulle selon laquelle ces différences reflèteraient des changements aléatoires pendant l' évolution ou la préparation des échantillons , il n' est pas attendu d' observer une telle correspondance au niveau de la direction des changements d' expression des gènes chez les clones évolués . Ainsi , les différences parallèles observées par ces deux approches ont sans doute une signification physiologique et sont vraisemblablement le reflet de mutations bénéfiques qui se sont produites au cours de l' évolution expérimentale . Une analyse plus détaillée des gènes dont l' expression est modifiée de façon parallèle a révélé que la moitié sont connus pour être régulés par ( p ) ppGpp , l' effecteur de la réponse stringente , un réseau de régulation permettant l' adaptation des bactéries à des conditions de carences nutritionnelles . Le séquençage des gènes impliqués directement dans le métabolisme de ( p ) ppGpp , relA et spoT , a révélé des mutations dans le gène spoT dans 8 des 12 populations , démontrant une fois de plus une évolution génétique parallèle . L' effet sur le fitness apporté par la mutation spoT a été mesuré par des expériences de compétitions entre la souche ancêtre dans laquelle une des mutations a été introduite et la souche ancêtre de départ . Cette mutation apporte un avantage considérable , d' environ 10 % . Un autre point commun révélé par la comparaison des profils transcriptionnels et protéiques consiste en une forte diminution de l' expression des gènes impliqués dans l' utilisation du maltose dans les deux populations analysées . Le séquençage du gène malT , codant l' activateur transcriptionnel de ces gènes , a révélé la présence de mutations dans 8 des 12 populations , induisant ainsi la diminution parallèle de la capacité à utiliser le maltose dans la majorité des populations . Des expériences de compétitions entre souches ancêtres isogéniques , excepté pour les mutations du gène malT , ont démontré leur effet positif sur le fitness d' environ 1 , 5 % . Seuls 3 types de mutations ont été démontrés comme apportant un bénéfice dans ces conditions d' évolution expérimentale chez E. coli . Elles affectent les gènes suivant : rbs ( avantage de 2 % ) , spoT ( avantage de 10 % ) , et malT ( avantage de 1 , 5 % ) . Si ces mutations ont un effet additif sur le fitness , le bénéfice total apporté n' est que de 13 à 14 % , ce qui est très éloigné de la valeur de fitness de 70 % en moyenne mesurée dans les clones évolués à 20 000 générations dans les 12 populations ( Cooper et Lenski , 2000 ) . De même , les clones évolués isolés à 2000 générations , après la période de forte augmentation du fitness ( Lenski et Travisano , 1994 ) , présentent en moyenne un fitness accru de 20 à 25 % . Ainsi , de nombreuses mutations bénéfiques sont encore inconnues , et certaines d' entre elles pourraient avoir un effet important sur le fitness . L' objectif de ma thèse entre dans le cadre de la thématique générale de l' équipe « Dynamique et Evolution des Génomes Microbiens » , qui est de comprendre les mécanismes écologiques et moléculaires de l' adaptation des bactéries à leur environnement . En particulier , la recherche de mutations bénéfiques , responsables de l' augmentation du fitness au cours de l' évolution expérimentale chez E. coli , en est le point d' orgue . Je me suis particulièrement intéressée à l' importance de la superhélicité de l' ADN dans les processus adaptatifs , les 12 populations ayant été adaptées à des transitions nutritionnelles pendant plus de 40 000 générations . Ces conditions sont en effet connues pour affecter le degré de superhélicité de l' ADN . Cette étude permettra notamment de répondre aux questions suivantes : la superhélicité peut -elle représenter une cible de la sélection naturelle , c' est-à-dire être impliquée dans les processus évolutifs et adaptatifs  ? Par quels types de modifications génétiques ? Un parallélisme phénotypique et génétique est -il sous-jacent à des changements éventuels de superhélicité de l' ADN ? Quels sont les mécanismes impliqués ? Résultats Les résultats de ce travail sont exposés ici en trois parties . Dans la première partie , nous avons montré que la superhélicité de l' ADN était la cible de la sélection naturelle au cours de l' évolution expérimentale . Des modifications parallèles de superhélicité ont ainsi été mises en évidence dans la majorité des 12 populations , et une population modèle , Ara- 1 , a été étudiée plus en détails . La seconde partie porte sur le prolongement de cette étude aux 11 autres populations et montre que le parallélisme phénotypique observé au niveau de la superhélicité de l' ADN a une base génétique . Enfin , la dernière partie détaille et caractérise au niveau moléculaire une des cibles de la sélection naturelle , le gène fis . Toutes les souches utilisées au cours de ce travail sont résumées dans le Tableau 1 . La nomenclature utilisée pour certaines souches a été modifiée entre la partie I des résultats et les parties II et III . Les correspondances sont données dans le Tableau 1 . Ces différences sont dues au fait que seule la population Ara- 1 ait été étudiée dans un premier temps et ces résultats ont été publiés ( Crozat et al. , 2005 ) . Ils ont ensuite été étendus aux autres populations , ce qui a nécessité une modification de nomenclature . Résultats Partie I La Topologie de l' ADN comme Cible de la Sélection Naturelle Cette partie a fait l' objet de la publication ci-jointe intitulée « Long-term Experimental Evolution in Escherichia coli . XII . DNA Topology as a Key Target of Selection » ( E. Crozat , N. Phlippe , J. Geiselman and D. Schneider , Genetics , 2005 , 169 : 523 - 532 ) . Tous les jours depuis 1988 , les cultures des douze populations sont diluées dans du milieu frais , après 24h d' incubation à 37 °C. Elles sont alors soumises à une phase de latence , suivie d' une période de croissance active qui est stoppée lorsque les nutriments s' épuisent . Les cellules entrent alors en phase stationnaire jusqu'au lendemain , où la dilution dans du milieu frais les place à nouveau dans des conditions favorables à leur croissance . Ces transitions croissance-carence et carence-croissance sont connues pour affecter la superhélicité de l' ADN . Des modifications de topologie de l' ADN sont par ailleurs connues pour modifier la transcription globale des gènes . Ceci pourrait ainsi permettre aux bactéries d' adapter rapidement l' expression de leurs gènes aux conditions de croissance , notamment lors des transitions nutritionnelles . La superhélicité de l' ADN a été mesurée au sein des 12 populations au cours de l' évolution . Ces mesures ont été réalisées en utilisant un plasmide rapporteur , ici pUC 18 , dont le niveau de superhélicité reflète qualitativement celui du chromosome . Ce plasmide rapporteur a été introduit dans 3 clones évolués isolés à 2000 , 10 000 et 20 000 générations de chacune des 12 populations , ainsi que dans le clone ancêtre . La distribution des topoisomères plasmidiques de tous les clones évolués a été comparée à celle du clone ancêtre par électrophorèse sur gels d' agarose contenant de la chloroquine . Cette molécule s' intercale dans l' ADN et permet de visualiser les différents topoisomères d' un plasmide . Les clones évolués de 10 populations sur 12 présentent une augmentation de superhélicité du chromosome à 20 000 générations par rapport à l' ancêtre . Parmi ces populations , 9 présentent des modifications importantes au cours des 2000 premières générations d' évolution , période d' amélioration rapide du fitness ( Lenski et Travisano , 1994 ; Cooper et Lenski , 2000 ) . L' augmentation de superhélicité de l' ADN est donc une modification phénotypique supplémentaire observée de façon parallèle dans la majorité des populations au cours de l' évolution ( voir Introduction Partie II ) . Les changements phénotypiques apparaissant de façon parallèle au sein de lignées indépendantes suggèrent une évolution adaptative . L' accroissement du niveau de superhélicité de l' ADN observé dans la majorité des populations dès 2000 générations , pendant la période de forte augmentation de fitness , pourrait donc être impliqué dans l' adaptation des bactéries aux conditions de l' évolution expérimentale . Les mutations susceptibles d' être à l' origine de cet accroissement de superhélicité ont été recherchées dans la population modèle Ara- 1 , utilisée dans la plupart des autres études génétiques réalisées . Cette population présente deux augmentations successives de superhélicité , l' une intervenant avant 2000 générations , l' autre après 10 000 générations . Ceci suggère l' implication d' au moins deux mutations , qui , après séquençage des gènes connus pour être impliqués dans la topologie de l' ADN , ont effectivement été mises en évidence dans deux de ces gènes . Une mutation cible le gène topA ( H33Y ) , codant la topoisomérase I , qui relâche les supertours négatifs , tandis que l' autre modifie le site de fixation des ribosomes ( RBS ) du gène fis , codant une protéine de type histone . La présence de ces mutations a alors été recherchée chez une cinquantaine de clones isolés à 500 , 1000 , 1500 , 2000 et 10 000 générations , ce qui a permis de déterminer leur dynamique de fixation au sein de la population Ara- 1 . La mutation du gène topA est apparue avant 500 générations et a été fixée entre 1000 et 1500 générations , bien avant la mutation du gène fis , fixée après 10 000 générations . Ceci correspond aux deux périodes où des changements de superhélicité ont été mesurés dans cette population Ara- 1 . Afin d' analyser les effets phénotypiques de ces mutations , elles ont été introduites seules ou en combinaison dans le contexte génétique ancestral , au moyen du plasmide suicide pKO 3 . Ceci a permis d' obtenir plusieurs souches ancestrales isogéniques à l' exception des allèles topA et/ou fis . De la même façon , un clone isolé à 2000 générations dans la population Ara- 1 a été modifié par remplacement de l' allèle évolué de topA par son allèle ancestral . Ces différentes constructions ont permis d' étudier l' effet des deux mutations sur la topologie de l' ADN , le fitness des bactéries , mais aussi sur l' activité de la topoisomérase I et l' expression de Fis . Des mesures de topologie de l' ADN ont été effectuées , de la même façon que précédemment , sur les souches portant les allèles évolués ou ancestraux de topA et fis . Chacune des deux mutations augmente la superhélicité négative de l' ADN plasmidique dans le contexte génétique de l' ancêtre . La mutation topA reproduit le changement de topologie observé chez les clones évolués isolés à 2000 générations dans la population Ara- 1 , tandis que les deux mutations combinées reproduisent les changements de topologie observés chez les clones évolués isolés à 20 000 générations . Ce résultat est étroitement corrélé à la dynamique de fixation des mutations : ainsi , la première augmentation de superhélicité correspondrait à la fixation de la mutation dans le gène topA , tandis que la deuxième correspondrait à la fixation de la mutation dans le gène fis . Ces deux mutations semblent donc être responsables de toutes les modifications de superhélicité observées dans la population Ara- 1 . Des expériences de compétition ont été réalisées entre les clones ancêtres portant les allèles évolués et ancestraux des gènes topA et fis . Ces expériences ont permis de montrer que l' allèle évolué du gène topA apporte un bénéfice important de 13 , 3 % , alors que l' allèle évolué du gène fis est bénéfique d' environ 3 % . Lorsque les deux mutations sont combinées , le gain de fitness est d' environ 16 % , ce qui n' est pas statistiquement différent d' un effet additif . Ces deux mutations permettent donc l' adaptation des bactéries aux conditions de l' évolution expérimentale . Elles ont un effet additif aussi bien en terme d' augmentation de superhélicité de l' ADN que de fitness . La mutation dans le gène topA touche un résidu très conservé ( Chen et Wang , 1998 ) du domaine I de la topoisomérase I , situé dans le domaine N-terminal , et probablement impliqué dans l' interaction avec l' ADN . La topoisomérase I a pour rôle de diminuer la superhélicité négative de l' ADN . L' allèle topA évolué entraînant une augmentation de superhélicité , il provoque probablement une baisse de l' activité de la topoisomérase I. L' effet de la mutation découverte dans le RBS du gène fis sur l' expression de la protéine a été analysé par western-blot en utilisant des anticorps dirigés contre Fis . Cette mutation provoque une diminution de la quantité de Fis , qui est un répresseur transcriptionnel de l' expression de gyrA et gyrB codant la gyrase . Ceci pourrait donc expliquer l' augmentation de superhélicité de l' ADN induite par cette mutation . La mutation topA est détectée de façon très précoce ( avant 500 générations ) , et ce dans 1 / 3 des individus testés à ce temps évolutif . Une mutation apportant un tel avantage ( 13 % ) aurait dû être fixée en moins de 200 générations , c' est-à-dire bien avant 1000 générations . Or il faut attendre 1500 générations pour que tous les individus analysés présentent l' allèle évolué du gène topA. Ceci pourrait être dû à un phénomène appelé interférence clonale . A une même étape de l' évolution , la population peut en effet être composée de plusieurs sous-populations constituées de cellules portant des mutations bénéfiques différentes mais apportant un avantage équivalent ( Gerrish et Lenski , 1998 ) . Cette compétition entraîne alors un retard de fixation des mutations . Il faut en effet attendre qu' une seconde mutation bénéfique apparaisse dans une des sous-populations , et que cette mutation confère une augmentation suffisante du fitness , pour permettre la fixation de cette sous-population aux dépends des autres . A 1000 générations , la population Ara- 1 serait donc constituée d' au moins 2 sous-populations , l' une composée de cellules portant l' allèle évolué de topA , l' autre de bactéries portant l' allèle ancestral de topA mais comportant une ou plusieurs autres mutations bénéfiques . Le fitness et le niveau de superhélicité de 4 clones évolués isolés à 1000 générations au sein de la population Ara- 1 ont été mesurés , 2 des clones ne portant pas l' allèle évolué de topA , les 2 autres le possédant . Or ces 4 clones présentent un fitness et un niveau de superhélicité de l' ADN similaires . Ce résultat signifie donc que les clones ne possédant pas l' allèle évolué de topA portent une ou plusieurs autres mutations ayant un effet équivalent sur le fitness . La topologie de l' ADN étant la même que pour la sous-population portant l' allèle évolué de topA , il est probable qu' une de ces mutations bénéfiques affecte également un gène impliqué dans le contrôle de la superhélicité de l' ADN . Ces expériences ont permis de mettre en évidence une nouvelle classe de mutations bénéfiques , permettant l' adaptation des bactéries aux conditions de l' évolution expérimentale . Elles affectent le degré de superhélicité de l' ADN , qui est un point de contrôle des transitions nutritionnelles et de la réponse aux stress chez les bactéries . La superhélicité de l' ADN est donc une cible majeure de la sélection naturelle . En effet , l' accroissement de superhélicité a été mis en évidence de façon parallèle dans la majorité des populations mais également dans différentes sous-populations éléments d' une même population . Résultats Partie II Evolution Bactérienne et Superhélicité de l' ADN : Degré Exceptionnel de Parallélisme Génétique et Phénotypique Cette partie s' inscrit dans la continuité des travaux décrits dans l' article précédent et fait l' objet de la publication ci-jointe intitulée « Bacterial Evolution by Exceptional Levels of Parallel Genetic Changes in DNA Superhelicity » ( E. Crozat , C . Winkworth , P. Fisher Hallin , M.A . Riley , R.E . Lenski and D. Schneider , à soumettre à la revue PLoS Biology ) . Dans la première partie des résultats , nous avons démontré une augmentation parallèle de la superhélicité négative de l' ADN dans 10 des 12 populations , cette augmentation intervenant dès 2000 générations pour la majorité des populations . Au sein de la population modèle Ara- 1 , la découverte et l' étude de mutations responsables de ces changements de superhélicité nous ont permis de suggérer que ces modifications étaient liées à une sélection positive au cours de l' évolution . Dans cette seconde partie des résultats , nous nous sommes intéressés aux changements génétiques liés aux modifications de superhélicité de l' ADN dans les 11 autres populations , afin de répondre aux questions suivantes : le parallélisme phénotypique observé au niveau de la superhélicité de l' ADN s' explique -t-il par un parallélisme génétique  ? Où sont localisées les mutations responsables de l' augmentation de superhélicité ? Quels sont leurs effets ? Les mêmes gènes sont -ils touchés par des mutations dans la majorité des populations ? Si oui , trouve -t-on les mêmes mutations plusieurs fois de façon indépendante ? Au moins deux hypothèses peuvent être envisagées à priori . A un extrême , il se peut que seul un accroissement de superhélicité de l' ADN soit important pour l' adaptation des bactéries à leur environnement . Dans ce cas , les différentes populations peuvent présenter des mutations dans tous types de gènes impliqués dans la superhélicité , pourvu qu' elles conduisent à une augmentation de superhélicité . A l' autre extrême , l' augmentation de fitness pourrait être liée à des fonctions particulières d' un petit nombre de gènes impliqués dans le contrôle de la superhélicité . Dans ce cas , seuls certains gènes de contrôle de la topologie seront les cibles de la sélection naturelle . Ainsi , la mise en évidence du degré de parallélisme génétique à la base des changements de superhélicité de l' ADN pourrait nous éclairer sur les mécanismes mis en jeu . Pour répondre à ces questions , nous avons séquencé 9 loci ( 17 gènes ) connus pour être impliqués dans la régulation de la topologie de l' ADN . Ces loci comprennent des gènes codant les topoisomérases ( gyrA , gyrB , parC , parE , topA , topB ) et des protéines de type histone ( dps , fis , hns ) . Dans les cas où les gènes se situent dans des opérons ( fis , parC , parE et topB ) , la totalité de ceux  -ci ont été séquencés , ce qui donne un total de 17 gènes et 23 102 pb . Chacun de ces loci a été séquencé dans un clone évolué isolé à 20 000 générations de chacune des 12 populations . Un total de 27 mutations a été mis en évidence ( Tableau 1 du manuscrit joint ) . Ces différentes séquences ont été comparées à celles réalisées pour 36 gènes choisis au hasard ( pour un total de 18 374 pb ) dans des clones évolués isolés à 20 000 générations dans chacune des 12 populations . Cette dernière étude n' a permis d' isoler que 6 mutations au sein de ces 36 gènes , toutes apparues dans des gènes différents et dans les populations devenues mutatrices au cours de l' évolution . ( Il est important de rappeler ici que 4 populations sur 12 présentent , bien avant 20 000 générations , un taux de mutation 100 fois supérieur à celui de l' ancêtre , suite à des mutations dans les gènes de réparation des mésappariements ) . Quatre tests statistiques ont été utilisés pour comparer ces deux catégories de gènes ( liés à la topologie de l' ADN ou choisis au hasard ) . Un degré exceptionnel de parallélisme génétique a été mis en évidence , avec seulement 3 gènes ( topA , fis et dusB ) soumis à sélection positive au cours de l' évolution . Malgré ce parallélisme génétique , les mutations identifiées dans chacun des 3 gènes dans les différentes populations sont différentes les unes des autres . L' analyse moléculaire des différents allèles évolués du gène fis ( modifié aux niveaux transcriptionnel , traductionnel et de la séquence codante ) nous a permis de montrer que ces mutations divergentes conduisaient cependant à des effets moléculaires similaires : une diminution de la quantité ou de l' activité de la protéine Fis . Cette seconde partie des résultats nous a permis également d' identifier de nouvelles mutations bénéfiques , encore inconnues dans ces populations et affectant le gène dusB. De plus , nos résultats suggèrent des fonctions communes entre fis et dusB. Enfin , l' effet du contexte génétique sur l' accroissement de superhélicité de l' ADN a été étudié . Tous ces résultats sont présentés en anglais sous la forme de l' article suivant . Cette étude a été complétée par l' analyse de l' effet de l' environnement sur le fitness conféré par les mutations isolées au sein de la population Ara- 1 affectant le niveau de superhélicité de l' ADN . En effet , l' adaptation prolongée au milieu de l' évolution est associée à une augmentation de la superhélicité de l' ADN , mais celle  -ci pourrait avoir des effets pleïotropes dans d' autres milieux . Nous avons donc réalisé des compétitions entre chacune des souches décrites précédemment , 606 topA - 1 , souche isogénique à l' ancêtre sauf pour la mutation topA de la population Ara- 1 , 606 fis - 1 , isogénique à l' ancêtre sauf pour la mutation fis de la population Ara- 1 , et la souche ancêtre de départ . Les résultats des expériences de compétitions sont résumés dans la Figure 28 . Les compétitions sont réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites dans la Partie I des résultats . Seul l' environnement , c' est-à-dire le milieu de culture ou la température d' incubation , est différent . Les effets initialement mesurés par des expériences de compétitions dans le milieu DM25 de l' évolution expérimentale sont une augmentation du fitness de 13 % pour la souche 606 topA - 1 par rapport à l' ancêtre et de 3 % pour la souche 606 fis - 1 . Dans tous les cas et dans tous les milieux testés , le marqueur arabinose a été vérifié comme étant neutre par compétition de l' ancêtre Ara + ( REL607 ) contre l' ancêtre Ara- ( REL606 ) . En milieu riche ( LB ) et à 37 °C , les deux mutations fis et topA apportent chacune un bénéfice considérable de 65 à 70 % par rapport à l' ancêtre . Cette augmentation de fitness est visible après seulement 24h de compétition . Pour donner un ordre de grandeur , rappelons que les clones évolués des 12 populations ont en moyenne un fitness accru de 70 % après 20 000 générations d' évolution et qu' ils possèdent plusieurs dizaines de mutations bénéfiques . Quand le milieu LB est dilué 2 fois , les valeurs de fitness sont toujours élevées : + 22 % pour la mutation topA et + 6 , 5 % pour la mutation fis . Ces valeurs sont intermédiaires entre celles mesurées en DM25 et en LB . Un lien potentiel entre taux de croissance et bénéfice apporté par ces deux mutations pourrait exister . Nous avons également testé l' effet des mutations dans un milieu contenant une autre source de carbone . Des compétitions ont été réalisées dans les mêmes conditions que l' évolution ( milieu minimum DM25 , 37 °C ) mais le glucose a été remplacé par du maltose . Encore une fois , les deux mutations confèrent une augmentation de fitness de 6 % pour la mutation topA et 2 % pour la mutation fis . Enfin , une sensibilité au froid ayant été observée dans des mutants & 206;& 148;topA ( Stupina et Wang , 2005 ) , nous avons testé l' effet d' une baisse de température sur le fitness de la souche 606 topA - 1 . A 30 °C , cette mutation s' est également révélée bénéfique en augmentant le fitness de 12 % , ce qui est similaire à l' effet observé sur le fitness à 37 °C. Ceci confirme l' effet modéré de la mutation sur l' activité de la topoisomérase I , celle  -ci étant diminuée , mais pas supprimée . Résultats Partie III Une Nouvelle Fonction de Régulation pour FIS Comme nous l' avons vu dans l' introduction , la superhélicité de l' ADN et la protéine Fis jouent un rôle primordial dans l' organisation du chromosome d' E. coli ainsi que dans la transcription de nombreux gènes . Des mutations dans les gènes topA et fis ayant été fixées au cours de l' évolution expérimentale , et démontrées comme étant bénéfiques ( voir Résultats , Partie I ) , nous avons voulu comprendre quels étaient les effets de ces mutations au sein de la cellule . Pour cela , nous avons réalisé des électrophorèses protéiques bidimensionnelles , pour comparer les profils protéiques globaux des souches isogéniques à l' ancêtre portant les allèles évolués topA ou fis isolés dans la population Ara- 1 , à celui du clone ancêtre . Quelques protéines dont la quantité est modifiée par ces mutations ont été identifiées , dont la porine majeure OmpF d' E. coli B. Des analyses moléculaires et biochimiques plus précises ont ensuite été réalisées . Matériel et méthodes Milieux de cultures , souches et plasmides Les souches analysées par électrophorèse bidimensionnelle ont été cultivées dans le milieu DM250 . Il s' agit du même milieu que celui utilisé lors de l' évolution expérimentale ( voir Résultats , Partie I ) , mais avec une concentration 10 fois plus élevée en glucose , ce qui permet l' obtention d' une quantité suffisante de protéines . Les souches 606 , 606 topA - 1 , 606 fis - 1 , 606 topA - 1 fis - 1 et 606 & 226;& 136;& 134; fis utilisées ici ont été décrites auparavant ( Tableau 1 ) , et dérivent toutes de l' ancêtre REL606 . La souche d' E. coli K12 utilisée est CF7968 ( MG1655 rph + & 206;& 148;lacI-Z ) et nous a été fournie par Michael Cashel . Une délétion de fis a également été construite dans cette souche , ce qui a conduit à la souche K 12 & 226;& 136;& 134; fis . Sa construction a été réalisée par recombinaison homologue dans le chromosome en utilisant le plasmide suicide pKO 3 ( comme décrit dans la Partie I des Résultats ) . Les plasmides pRS 550 et pRS 551 , permettant la construction de fusions transcriptionnelles avec le gène rapporteur lacZ , ont été décrits par Simons et al. ( 1987 ) . Electrophorèses bidimensionnelles Le principe est d' effectuer une double séparation sur un échantillon protéique , la première se faisant en fonction du point isoélectrique et la seconde en fonction de la masse molaire des protéines . Des précultures de nuit des souches d' intérêt ont été réalisées dans du milieu DM250 , puis diluées au 1 / 100ème dans 1L de milieu DM250 , incubées à 37 °C avec agitation jusqu'à une DO 600 nm = 0 , 1 ( début de phase exponentielle ) , et centrifugées . Les culots sont lavés dans 50 mM de Tris pH 8 , resuspendus dans 200 µL d' une solution de 50 mM Tris pH 8 , 0 , 2M DTT , 0 , 3 % SDS et 1 mM EDTA , et chauffés à 100 °C pendant 5 min . Vingt microlitres d' une solution contenant 50 mM Tris pH 7 , 5 , 50 mM MgCl 2 , 1 mg / mL DNaseI et 0 , 25 mg / mL RNase A sont ajoutés aux extraits cellulaires et le tout est incubé pendant 10 min sur la glace . Les protéines sont solubilisées par l' ajout de 800 µL d' un tampon contenant 10M urée , 4 % NP40 , 0 , 1M DTT et 2 , 2 % ampholines avec une gamme de pH allant de 3 à 10 ( v / v ) ( Amersham Pharmacia ) . Les échantillons sont stockés à - 20 °C. Les électrophorèses bidimensionnelles en gels de polyacrylamide ont été réalisées avec un système Multiphor II ( Amersham Pharmacia ) pour l' isoélectrofocalisation et Protean II xi cell ( Bio-Rad , Hercules , CA ) pour la seconde dimension . Les bandes de première dimension ( 18 cm , gamme de pH de 4 à 8 ) sont réhydratées dans les échantillons protéiques ( 500 mg ) préparés dans 2M thiourée , 5M urée , 1 , 6 % 3 - [ ( 3- cholamidopropyl ) -diméthylammonio ] - 1- propanesulfonate ( p / v ) , 100 mM DTT et 0 , 8 % ampholines . L' isoélectrofocalisation est effectuée jusqu'à atteindre l' équilibre de pH ( Lelong et Rabilloud , 2003 ) . Les bandes sont ensuite équilibrées pendant 10 min dans une solution de Tris pH 6 , 8 contenant 2 , 5 % SDS , 30 % glycérol , 6M urée et 50 mM DTT . Cette étape est effectuée une seconde fois en remplaçant le DTT par 100 mM d' iodoacétamide . Pour la seconde dimension , l' électrophorèse est réalisée comme décrit précédemment ( Laemmli , 1970 ) , en utilisant des gels d' acrylamide à 12 % , avec les modifications suivantes : les tampons de migration de la cathode et de l' anode sont remplacés par une solution de 50 mM Tris , 0 , 1 % SDS et 200 mM taurine ou 380 mM glycine , respectivement . Les protéines sont ensuite colorées au bleu de Coomassie ou au nitrate d' argent . Analyse des électrophorèses bidimensionnelles Le profil protéique global des 5 souches ( 606 , 606 topA - 1 , 606 fis - 1 , 606 topA - 1 fis - 1 , 606 & 206;& 148; fis ) a été réalisé en triplicats à partir de 3 cultures indépendantes de chaque souche . Chaque série de 5 souches a été effectuée le même jour , avec les mêmes solutions , pour donner un maximum de reproductibilité . Chaque profil a été comparé à celui de l' ancêtre , et seules les protéines dont la quantité variait dans le même sens pour chacun des 3 réplicats ont été analysées . Les spots correspondants ont été excisés à partir de gels colorés au bleu de Coomassie , oxydés par 7 % de H2O2 , et soumis à une digestion tryptique . Les peptides ont été analysés par MALDI & 226;& 128;& 147; TOF & 226;& 128;& 147; MS ( matrix-assisted laser desorption ionization & 226;& 128;& 147; time of flight & 226;& 128;& 147; mass spectrometry ) par resuspension dans une solution matrice ( acide & 206;& 177;-cyano- 4- hydroxycinnamique à mi-saturation dans 60 % d' acétonitrile et 0 , 1 % d' acide trifluoroacétique ) . L' analyse est ensuite faite avec un spectromètre de masse MALDI-TOF ( Autoflex , Bruker Daltonik , Bremen , Allemagne ) en mode extraction avec une gamme de masse de 0 à 4200 Da . Une recherche consécutive automatique dans la base de données Swissprot Trembl a été effectuée à l' aide du logiciel Mascot . Lorsqu' aucun résultat n' a été obtenu par cette méthode , une analyse par nano-LC & 226;& 128;& 147; TMS / MS ( nano-liquid chromatography & 226;& 128;& 147; tandem mass spectrometry ) a été réalisée . Les peptides ont alors été extraits avec de l' acide formique et de l' acétonitrile et injectés dans un système CapLC ( Waters , Milford , MA ) nanoLC directement couplé à un spectromètre de masse QTOF Ultima ( Waters ) . L' acquisition des données est faite avec le logiciel MassLynx ( Waters ) , et l' identification des protéines est alors effectuée de la même façon que précédemment . Toutes les analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées par Lauriane Kühn dans le cadre d' une collaboration avec le laboratoire Chimie des Protéines ( DRDC-CI , ERM0201 CEA / INSERM / UJF , CEA , Grenoble ) dirigé par Jérôme Garin . Fusions transcriptionnelles La transcription des gènes ompF , ompC , ompR , micF et greB a été analysée par construction de fusions transcriptionnelles des promoteurs de chacun de ces gènes avec le gène rapporteur lacZ , codant la & 206;& 178;-galactosidase . Les gènes micF et greB ont été inclus dans cette analyse car leur région promotrice est adjacente et divergente de celle de ompC et ompR , respectivement . Les fragments contenant les différentes régions promotrices ont été amplifiés par PCR , puis clonés dans le plasmide pCRII-TOPO ( Invitrogen ) . Pour ompF , le fragment amplifié s' étend des positions - 422 à + 148 ( amorces ODS 451 : 5 ' -gcagggacgatcactgccag- 3 ' et ODS 453   : 5 ' -agtcaagcaatctatttgca- 3 ' ) et l' ADN chromosomique d' E. coli B ou K12 a été utilisé . Pour ompC , le fragment s' étend des positions - 211 à + 110 ( amorces ODS 456 : 5 ' -accaggagggacagtacttt- 3 ' et ODS 457 : 5 ' -cagtgctgtcaaatacttaag- 3 ' ) et a été amplifié à partir d' ADN chromosomique d' E. coli K12 . Pour ompR , le fragment s' étend des positions - 116 à + 199 ( amorces ODS 396 : 5 ' -cggtgagataacgttccagcag- 3 ' et ODS 455 : 5 ' -gggcgttttcatctcgttga- 3 ' ) et a été amplifié à partir d' ADN chromosomique d' E. coli B. Pour le promoteur de micF , le fragment cloné s' étend des positions - 304 à + 110 et les amorces utilisées sont ODS456 et ODS460 ( 5 ' -acagagattcaggatccgaatgacggtaa- 3 ' ) et a été amplifié à partir d' ADN chromosomique d' E.   coli K12 . Toutes les positions nucléotidiques sont données par rapport au site + 1 majeur d' initiation de la transcription pour chacun des gènes . La séquence de chacun des fragments a ensuite été vérifiée par séquençage , puis les fragments contenant les promoteurs des gènes ompF , ompC et micF ont été clonés dans le plasmide pRS 551 .. La région promotrice de ompR a quant à elle été clonée à la fois dans pRS 551 et pRS 550 , dont le site multiple de clonage est inversé par rapport à pRS 551 , afin d' obtenir les fusions transcriptionnelles ompR-lacZ et greB-lacZ . ( Les gènes ompR et greB sont divergents ) . Les fusions transcriptionnelles ont ensuite été réalisées de la même façon que précédemment ( voir Résultats , Partie II , Materials and Methods ) par intégration du bactériophage & 206;& 187;RS 45 dans le chromosome de la souche d' intérêt et sélection et criblage des bactéries lysogènes sur les phénotypes de résistance à la kanamycine , dont le gène conférant la résistance est porté par pRS 550 , pRS 551 et & 206;& 187;RS 45 , et de couleur bleue sur milieu contenant de la kanamycine et du Xgal . Retards sur gels La fixation de Fis sur les régions promotrices de ompF , ompC et ompR a été étudiée par des expériences de retards sur gel . Tous les fragments d' ADN utilisés recouvrent les régions promotrices ainsi que les sites d' initiation de la transcription des gènes . Les mêmes fragments que ceux clonés pour la construction des fusions transcriptionnelles ( voir paragraphe précédent ) ont été amplifiés par PCR . Les marquages radioactifs , ainsi que les conditions utilisées lors des expériences de retards sur gel , sont les mêmes que ceux décrits précédemment ( voir Résultats , Partie II , Materials and Methods ) . Les contrôles pour tester la spécificité des retards observés sont également similaires à ceux décrits et utilisés précédemment . Empreintes à la DNase I Les mêmes fragments d' ADN que ceux utilisés pour les retards sur gel ont été employés pour réaliser les empreintes à la DNase I , ainsi que la protéine Fis ancestrale purifiée comme décrit dans la Partie II des résultats ( Materials and Methods ) . Pour chaque fragment d' ADN , les empreintes à la DNase I ont systématiquement été réalisées avec chacun des deux brins marqués , correspondant respectivement aux brins codant et non codant . Les marquages ont été réalisés par la T4 nucléotide kinase en marquant avec du & 206;& 179;-32P dATP ( Amersham ) l' extrémité 5 ' de chacune des deux amorces utilisées pour amplifier chacun des fragments d' ADN . Pour ompF , en plus du fragment obtenu à l' aide des amorces ODS451 et ODS453 , deux autres fragments ont été utilisés , obtenus à l' aide des amorces ODS453-ODS458 ( 5 ' -ctaaacggaaattttgtttcgt- 3 ' ) et ODS452-ODS459 ( 5 ' -cagaaacaaaatttccgtttag- 3 ' ) , pour confirmer l' empreinte à la DNase   I ( Figure 34 ) . La quantité de fragment radiomarqué dans une réaction d' empreinte à la DNase I est ici de 30 cpm par tube ; les rendements de la réaction de radiomarquage ainsi que de la purification des produits PCR radiomarqués ( PCR purification kit , Qiagen ) n' étant pas toujours constants , la dilution appropriée pour obtenir 30 cpm / tube a été systématiquement déterminée , et la quantité d' ADN présent dans le volume utilisé calculée . La quantité de protéine Fis à ajouter dans chaque échantillon a ainsi été déterminée afin d' obtenir le même rapport molaire que lors des expériences de retards sur gels . C' est ce rapport molaire qui est donné dans les figures . Les complexes Fis / ADN ont été réalisés dans les mêmes conditions que pour les retards sur gel ( voir Résultats Partie II , Materials and Methods ) , dans le même tampon et dans un volume total de 15 µL. Après 20 min d' incubation à 37 °C , les échantillons sont traités par 0 , 75 ng de DNase I ( Worthington ) pendant 35s à température ambiante . La réaction est arrêtée par l' ajout de 50 µL de phénol pur pH 8 , puis 180 µL d' une solution d' arrêt ( 12 , 5 mM EDTA pH 8 , 0 , 4M acétate de sodium et 250 µg ADN de sperme de hareng ) sont ajoutés . L' ADN est ensuite précipité puis resuspendu dans 5 µL de bleu de formamide ( 10 mM EDTA pH 8 , 5 mg bleu de bromophénol et xylène cyanol dans 10 mL de formamide ) , chauffé à 90 °C pendant 3 min et déposé sur un gel de polyacrylamide à 8 % ( TBE 1X , 1 , 5M urée ) . Afin de déterminer les positions des sites de fixation de Fis , une réaction de séquençage G + A de Maxam et Gilbert ( Maxam et Gilbert , 1977 ) , réalisée sur le même fragment radiomarqué , est déposée en parallèle sur le gel . L' électrophorèse est réalisée dans un tampon TBE 0 , 5X et , après un temps de migration adéquat , le gel est séché 1h30 à 80 °C , et révélé de la même manière que les gels de retards . Résultats Modification des profils protéiques Les profils protéiques de 4 souches ancestrales isogéniques portant les allèles évolués de topA et fis identifiés dans la population Ara- 1 , seuls ou en combinaison , ou une délétion de fis ( 606 topA - 1 , 606 fis - 1 , 606 topA - 1 fis - 1 , 606 & 206;& 148; fis ) ont été comparés à celui du clone ancêtre par électrophorèses bidimensionnelles . Trois profils protéiques ont été réalisés à partir de trois cultures indépendantes de chacune des souches dans du milieu DM250 , les protéines ayant été extraites en phase exponentielle . Seules les protéines dont la quantité variait de manière similaire au sein des 3 réplicats ont été identifiées par MALDI-TOF-MS ou LC-MS . La liste de ces protéines est donnée dans le Tableau 2 . Trois protéines varient ici de manière systématique soit dans les 4 souches , soit dans les 3 modifiées pour fis  : PAL , OmpA et OmpF. Ces deux dernières protéines sont des porines , OmpF étant la porine principale présente chez E. coli B. Chez E. coli K12 , les deux porines majeures sont OmpF et OmpC. Cette dernière est absente chez les dérivés de la souche E. coli B utilisés ici , suite à la délétion d' une partie du gène ompC . Nous avons choisi de nous focaliser sur les analyses des porines , et notamment de OmpF. En effet , la composition de la membrane externe pourrait jouer un rôle important au cours de cette évolution expérimentale . Nous avons donc étudié l' expression du gène ompF dans nos souches ancestrales isogéniques portant les allèles ancestraux ou évolués de topA et fis . Avant de détailler les expériences effectuées , une brève description des porines d' E. coli et de leur régulation est donnée . Les porines d' E. coli Trois porines majeures ont été décrites chez E. coli : OmpC , OmpF et OmpA. Les porines sont des protéines insérées dans la membrane externe , qui forment des pores permettant l' entrée passive de petits composants . Elles sont impliquées dans le transport de molécules , la discrimination se faisant essentiellement sur la base de leur taille . Les deux principales , OmpC et OmpF , se différencient par la taille des pores formés , OmpF formant des pores de 1 , 16 nm , alors que ceux formés par OmpC sont plus petits ( 1 , 08 nm ) et rendent ainsi plus difficile la diffusion des molécules ( Nikaido et Rosenberg , 1983 ) . La quantité de chacune de ces porines est fonction de la composition du milieu dans lequel se trouve la cellule , et leur régulation se fait de façon opposée . Dans l' intestin par exemple , la concentration en nutriments , mais aussi en composés toxiques comme les sels biliaires , est élevée : dans ces conditions , la quantité de porine OmpC est plus élevée que celle de OmpF . Dans un milieu plus dilué , l' inverse se produit ( Pratt et Silhavy , 1995 ) . Dans des conditions de stress osmotique , OmpC est également majoritaire par rapport à OmpF. Ces changements d' expression sont dus à différentes voies de régulation des deux porines , et les mécanismes de régulation ont été particulièrement bien étudiés dans le cas d' un stress osmotique . La régulation majeure exercée au niveau transcriptionnel passe par l' intermédiaire du système à deux composants OmpR / EnvZ ( Hall et Silhavy , 1981 ) . La protéine senseur EnvZ , une histidine kinase , est insérée dans la membrane externe et détecte les variations d' osmolarité de l' environnement . Ses activités de phosphorylation et de déphosphorylation exercées sur le régulateur de réponses OmpR permettent de réguler l' expression de OmpC et OmpF. En effet , suite à des variations d' osmolarité , il y a autophosphorylation de EnvZ sur le résidu H243 , puis transfert du groupement phosphate sur le résidu D55 de OmpR , qui régule la transcription des deux porines , la phosphorylation de OmpR accroissant sa capacité à se fixer sur les régions promotrices de ompF et ompC ( Aiba et Mizuno , 1990 ) . A faible osmolarité , la quantité de OmpR phosphorylé ( OmpR-P ) est faible , et OmpR-P se fixe alors de façon coopérative sur trois sites à haute affinité , appelés F1 à F3 , localisés en amont du promoteur de ompF ( Figure 29 ) . Ceci entraîne l' activation de la transcription de ompF , probablement grâce à une interaction avec l' ARN polymérase ( Pratt et Silhavy , 1994 ) . En revanche , cette concentration de OmpR-P n' est pas suffisante pour occuper les trois sites C1 à C3 de la région promotrice de ompC et entraîne donc une transcription à un niveau basal de ce gène . L' expression des porines est également régulée de façon post-transcriptionnelle par de petits ARNs , MicF , MicC et MicA , dont la séquence est complémentaire de l' extrémité 5 ' non traduite des ARNm de OmpF , OmpC et OmpA , respectivement . Ainsi , l' hybridation de ces trois ARNs au niveau des ARNm entraîne l' inhibition de la traduction de OmpF , OmpC et OmpA. De plus , le gène micF est transcrit de façon divergente à ompC ( Figure 29A ) , et est activé de la même façon en cas de stress osmotique . Ceci a pour effet une inhibition très rapide de OmpF dans ces conditions . La régulation de ompF par H-NS et Lrp est réalisée par l' intermédiaire de micF . Chez E. coli B , une région correspondant à la totalité de micF et à une partie de ompC est délétée . Ainsi , OmpF est la seule porine majoritaire présente chez E. coli B etsa régulation négative par micF est absente . Au vu des résultats obtenus par électrophorèse bidimensionnelle , nous nous sommes d' abord intéressés à l' effet des mutations topA et fis sur la transcription de ompF chez E. coli B dans nos souches isogéniques dérivées du clone ancêtre . Effets des mutations topA et fis sur la transcription de ompF La transcription de ompF dépend de la superhélicité de l' ADN et de Fis Une fusion transcriptionnelle a été construite pour le promoteur du gène ompF d' E. coli B ( ompFB ) avec le gène rapporteur lacZ , codant la & 206;& 178;-galactosidase . Cette fusion a été introduite à l' aide du bactériophage & 206;& 187;RS 45 dans le chromosome du clone ancêtre , ainsi que des souches isogéniques dérivées 606 topA - 1 , 606 fis - 1 et 606 & 206;& 148; fis . Des mesures d' activité & 206;& 178;-galactosidase ont alors été effectuées en fonction de la phase de croissance et de la concentration en NaCl , et chacune des expériences a été réalisée à partir de 3 cultures indépendantes . Les prélèvements réalisés pour chaque souche au cours du temps ( Figure 30 ) , montrent que la transcription de ompF chez E. coli B est quasiment constitutive , avec une légère baisse en fin de phase exponentielle . Une diminution de la transcription est observée dans la souche 606 topA - 1 . Cette mutation entraînant une augmentation de superhélicité de l' ADN , ceci pourrait indiquer un rôle potentiel de la superhélicité dans l' activité de ce promoteur , ce qui a été suggéré auparavant . Cette baisse de transcription est observée pendant toute la croissance cellulaire , avec cependant un effet plus marqué ( diminution de la transcription de 3 fois ) en phase exponentielle . Une baisse de transcription de l' ordre de 3 fois est également observée suite à une diminution de quantité ou à une disparition de Fis ( souches 606 fis - 1 et 606 & 206;& 148; fis , respectivement ) . Ces résultats confirment les profils protéiques . Ainsi , Fis activerait la transcription de ompF de façon directe ou indirecte . Cette régulation est spécifique de la phase exponentielle et n' est plus observée en phase stationnaire . Ceci est cohérent avec le profil d' expression de Fis , protéine très abondante en phase exponentielle mais quasiment absente en phase stationnaire ( voir Introduction Partie I , I.B.3 ) . La transcription du promoteur ompFB a également été mesurée , grâce à la même fusion transcriptionnelle , dans les souches 606 et 606 & 206;& 148; fis en fonction de la concentration en NaCl , c' est-à-dire en absence et en présence d' un stress osmotique ( Figure 31 ) . Trois concentrations en NaCl ont été utilisées : 0 , 086M , correspondant à la concentration habituelle du milieu LB , 0 , 2M et 0 , 5M . Deux prélèvements ont été effectués pour chaque souche et chaque concentration , en début de phase exponentielle ( DO 600 nm = 0 , 2 ) et en phase stationnaire ( DO 600 nm = 4 ) . Bien que le stress osmotique soit connu pour entraîner l' inhibition de la transcription de ompF chez E. coli K12 et ses dérivés , cette inhibition n' a pas été observée ici chez E. coli B ( Figure 31 ) . Une légère augmentation de la transcription de ompF semble même se produire en augmentant la concentration en NaCl . Ces résultats devraient être confirmés en introduisant dans nos expériences une souche E. coli K12 , ainsi qu' un dérivé délété du gène fis ( ces travaux sont en cours ) . D' autre part , la validité du stress osmotique devra également être réalisée par utilisation d' un milieu minimum additionné ou non de saccharose . La régulation de ompF B par Fis révèle quelques différences lors d' un stress osmotique ( Figure 31 ) . En milieu LB classique ( 0 , 086M NaCl ) , l' activation de la transcription de ompF B par Fis a été retrouvée , uniquement en phase exponentielle . En revanche , lorsque la concentration en NaCl augmente , l' activation de la transcription de ompF B par Fis est détectée aussi bien en phase exponentielle qu' en phase stationnaire . De plus amples expériences seraient ici nécessaires afin de comprendre le rôle joué par Fis dans la régulation de ompF B en fonction du stress osmotique . Notamment , l' expression de Fis en fonction de la concentration en NaCl devrait être analysée . Ces expériences sont actuellement en cours au laboratoire . L' activation de ompF par Fis est directe Afin de savoir si le mécanisme d' activation de ompF par Fis était direct ou indirect , des retards sur gels ont été réalisés en utilisant d' une part la protéine Fis purifiée à partir de la souche ancêtre ( voir Résultats , Partie II ) et d' autre part la région promotrice de ompF , amplifiée également à partir de la souche ancêtre ( Figure 32 ) . Un retard est visible dès 0 , 2 nM de Fis et augmente jusqu'à une concentration en protéine de 40 nM ( Figure 32A ) . De multiples bandes retardées sont observées , ce qui pourrait indiquer la présence de plusieurs sites de fixation de Fis dans la région promotrice de ompF. La constante de dissociation , calculée de la même façon que dans la Partie II des résultats ( Materials and Methods ) est de 2 nM. Trois types de contrôles pour tester la spécificité de la fixation ont été effectués . Le premier a consisté à ajouter un anticorps anti-Fis au mélange ADN-Fis . Un retard de migration supplémentaire ( supershift ) a été observé ( résultat non montré ) . Le second a consisté à remplacer la protéine Fis purifiée par une fraction plus tardive de la purification sur SP-sépharose par FPLC ( voir Résultats Partie II , Materials and Methods ) . Aucun retard de migration n' a alors été constaté ( résultat non montré ) . Enfin , le troisième contrôle a consisté à ajouter deux types d' oligonucléotides non marqués radioactivement , en quantités croissantes , au mélange ADN-Fis ( Figure 32B ) . Le premier type contient une séquence consensus de fixation de Fis ( Finkel et Johnson , 1992 ) , ici le site I à haute affinité présent dans la région promotrice du gène fis lui-même ; dans ce cas , le retard de migration observé diminue rapidement avec l' augmentation de la concentration de l' oligonucléotide . Le deuxième type correspond à la même séquence d' ADN mais pour laquelle le site de fixation de Fis a été mutagénisé . Aucune différence de retard de migration n' a alors été observée , quelle que soit la concentration en oligonucléotide . Tous ces contrôles démontrent que la fixation de Fis sur le promoteur ompF est spécifique . Ces résultats montrent également que Fis active la transcription de ompF de manière directe , en se fixant sur la région promotrice du gène . Détermination des sites de fixation de Fis sur ompF Afin de déterminer précisément les sites de fixation de Fis dans la région promotrice de ompF , nous avons réalisé des empreintes à la DNase I sur cette région protégée par Fis ( Figure 33 ) . Des quantités croissantes de Fis ont été employées , correspondant aux rapports molaires utilisés dans les expériences de retards sur gel . Quatre couples d' amorces ont été utilisés ( Figure 34 ) pour amplifier par PCR quatre fragments d' ADN de la région promotrice de ompF B , qui ont ensuite permis de réaliser des expériences d' empreintes à la DNase I ( Figure 33 ) . Les empreintes à la DNase I révèlent 5 zones de protection par Fis dans la région promotrice de ompF , au sein desquelles desquelles sont observés des sites d' hypersensibilité ( Figure 33 ) caractéristiques de la courbure engendrée par la fixation de Fis sur l' ADN , ce qui exposerait particulièrement quelques bases localisées entre les deux domaines C-terminaux de Fis ( Slany et Kersten , 1992 ) . Cinq sites de fixation de Fis , I à V , ont ainsi été mis en évidence ( Figure 34 ) . Le premier est situé en amont de la boîte - 35 du promoteur , chevauchant les sites F1 , F2 et F3 de fixation de OmpR , ainsi qu' un des sites de fixation d' IHF . L' étendue de ce premier site , des positions - 45 à - 118 , laisse supposer la fixation de plusieurs dimères de Fis , bien qu' un seul site proche de la séquence consensus ait pu être identifié . La localisation de ce site pourrait également suggérer des interactions entre Fis et OmpR au niveau de la régulation de ompF . Les quatre autres sites de fixation de Fis s' étendent des positions - 130 à - 363 et sont tous localisés entre les sites F1 et F4 de fixation de OmpR. Le centre des différents sites de fixation de Fis est espacé , respectivement de 69 pb ( I à II ) , 82 pb ( II à III ) , 60 pb ( III à IV ) et 54 pb ( IV à V ) . L' éloignement de ces sites pourrait suggérer que les dimères de Fis puissent se fixer pour la plupart du même côté de la double hélice d' ADN et y induire une forte courbure qui entraînerait l' activation de la transcription . In vivo , cette région pourrait déjà présenter une courbure intrinsèque importante , puisqu' elle est riche en AT , à laquelle viendrait s' ajouter celle induite par la fixation de Fis . Nous avons ici démontré que Fis activait la transcription du gène ompF d' E. coli B en se fixant sur 5 sites présents dans la région promotrice . Bien que la régulation des porines soit relativement bien connue chez E . coli K12 , et étudiée depuis plus de 30 ans maintenant , aucune régulation par Fis des gènes de porines , que ce soit ompF ou ompC , ou des gènes de régulation ompR et envZ , n' a été répertoriée , ce qui peut paraître surprenant . Ceci pourrait être lié au fait que la régulation que nous venons de mettre en évidence soit spécifique d' E. coli B. Nous avons donc réalisé les mêmes expériences dans l' isolat d' E. coli le plus utilisé en laboratoire : K12 . Pour ce faire , nous avons utilisé la souche CF7968 , un dérivé Lac- de la souche MG1655 , dont la séquence du génome est disponible . Au préalable , nous avons construit , toujours en utilisant le plasmide suicide pKO 3 , une délétion en phase du gène fis dans la souche CF7968 ( appelée K12 ) , ce qui nous a permis d' obtenir une souche isogénique CF 7968 & 206;& 148; fis ( appelée K 12 & 206;& 148; fis ) . La régulation des gènes ompF et ompR a été comparée dans les 4 souches : B , K12 , ainsi que leurs dérivés délétés du gène fis . L' utilisation d' un contexte génétique K12 nous a également permis d' inclure l' analyse de la régulation du gène ompC , absent chez les dérivés d' E. coli B. La régulation de chacun de ces gènes a été analysée en fonction de la phase de croissance , en phase exponentielle et en phase stationnaire . Régulation des gènes ompF , ompC et ompR chez E. coli B et K12 Les trois mêmes types d' analyses ont été réalisés pour les régions promotrices de chacun des trois gènes : des fusions transcriptionnelles avec le gène lacZ , des retards sur gel pour analyser la fixation de Fis , et des empreintes à la DNase I pour identifier les sites de fixation potentiels . Régulation du gène ompF K12 Les fusions transcriptionnelles du promoteur ompFK 12 ont été construites comme précédemment ( voir paragraphe I.D. de cette partie ) par clonage dans pRS 551 d' un produit PCR correspondant à la région promotrice de ompF mais obtenu cette fois à partir de l' ADN génomique de K12 , transfert sur l' ADN de & 206;& 187;RS 45 et introduction dans le chromosome par lysogénisation des souches K12 et K 12 & 206;& 148; fis . Le promoteur ompFK 12 contient trois mutations par rapport à celui d' E. coli B ( Figure 34 ) , localisées dans les sites de fixation F2 et F4 de OmpR et entre les boîtes - 35 et - 10 du promoteur . Les cultures des deux souches K12 et K 12 & 206;& 148; fis portant les fusions transcriptionnelles ont été réalisées en triplicats dans du milieu LB . Des prélèvements ont été effectués au cours de la croissance et des mesures d' activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase ont été réalisées ( Figure 35 ) . Contrairement au promoteur ompFB dont la transcription était quasiment constitutive tout au long de la croissance ( Figure 30 ) , la transcription de ompFK 12 présente un niveau de base en phase exponentielle de croissance et est activée en phase stationnaire ( Figure 35 ) pour atteindre un niveau d' expression semblable à celui de ompFB . Une seconde différence a été observée entre ompFK 12 et ompFB : Fis ne semble pas réguler la transcription de ompFK 12 , ce qui pourrait expliquer l' absence d' activation du promoteur ompFK 12 en phase exponentielle par rapport à ompFB ( Figures 30 et 35 ) . Une hypothèse qui permettrait d' expliquer en partie ce résultat serait que Fis ne se fixe pas sur le promoteur de K12 , malgré de faibles différences entre les séquences des promoteurs ompFB et K12 . Des expériences de retard sur gel ont donc été effectuées dans les mêmes conditions que celle décrites dans le paragraphe II.C . 2 . , mais cette fois avec un fragment d' ADN correspondant au promoteur ompFK 12 ( obtenu par PCR avec les mêmes amorces que précédemment ) . La fixation de Fis sur ompFK 12 est strictement équivalente à celle de Fis sur ompFB , avec une constante de dissociation de 1 , 5 nM ( résultats non montrés ) . Ce n' est donc pas une différence de liaison à l' ADN qui explique les différences de régulation observées entre ompFB et ompFK 12 . Afin de comprendre les différences de régulation entre ompFB et ompFK 12 , nous avons mesuré l' activité des deux promoteurs en introduisant chacune des fusions transcriptionnelles ompFB-lacZ et ompFK 12 -lacZ dans chacune des souches E. coli B et K12 . Des cultures des deux souches portant chacune des deux fusions transcriptionnelles ont été réalisées en triplicat en milieu LB . Des prélèvements ont été effectués au cours de la croissance et les activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase ont été mesurées ( Figure 36 ) . Les deux résultats précédents ont été retrouvés : l' activité constitutive du promoteur ompFB dans E.   coli B et l' activation du promoteur ompFK 12 dans E.   coli K12 en phase stationnaire et à des niveaux équivalents à ceux de ompFB . En revanche , la fusion transcriptionnelle ompFK 12 -lacZ exprimée dans E. coli B révèle maintenant une expression de base , et donc une absence d' activation , en phase exponentielle , alors qu' une activation est toujours observée en phase stationnaire ( Figure 36 ) . Une légère diminution de la transcription se produit par la suite . Ainsi , il semblerait que les trois changements nucléotidiques entre les promoteurs ompFB et K12 pourraient être à l' origine des différences de transcription observées en phase exponentielle . Ces trois modifications nucléotidiques ( ou l' une ou deux d' entre elles ) chez E .  coli B pourraient être à la base de l' activation de la transcription par Fis . Nous sommes actuellement en train de tester l' activation par Fis de ompFK 12 dans le contexte génétique d' E. coli B . Cependant , ces modifications de séquences nucléotidiques entre ompFB et ompFK 12 ne semblent pas être suffisantes pour expliquer les différences de régulation observées . En effet , la fusion transcriptionnelle ompFB-lacZ exprimée dans E. coli K12 révèle le même comportement que ompFK 12 -lacZ , c' est-à-dire une expression de base en phase exponentielle suivie d' une activation en phase stationnaire ( Figure 36 ) . Ceci indique , en plus des différences de séquences nucléotidiques entre les promoteurs ompFB et K12 , des différences de régulation entre les deux isolats d' E. coli . En particulier , des différences de séquences ont été identifiées dans les gènes ompR et envZ entre les deux isolats , ce qui pourrait expliquer une partie des différences de régulation observées . Ceci sera abordé dans la partie Discussion de ce chapitre . Nous avons donc montré ici que la protéine Fis se fixait sur le promoteur de ompF de K12 , sans pour autant avoir d' effet détectable sur sa transcription dans les conditions testées . Ceci est différent du promoteur ompFB qui est activé par Fis en phase exponentielle . Nous avons également démontré que deux conditions étaient nécessaires à cette activation de ompFB par Fis : la séquence promotrice issue de la souche B , ainsi que le contexte génomique d' E.   coli B. Il est donc probable que les différences de régulation observées soient fonction de plusieurs facteurs , dont par exemple des différences au niveau du système à deux composantes OmpR / EnvZ . Régulation des gènes ompC et ompR Des fusions transcriptionnelles ompC-lacZ et ompR-lacZ ont été construites de la même façon que celle décrite précédemment pour ompF , avec les fragments d' ADN contenant les régions promotrices de ompC et ompR provenant respectivement des souches E. coli K12 et B . Les fusions transcriptionnelles ont été introduites au site d' attachement de l' ADN du bactériophage & 206;& 187; dans les souches 606 , 606 & 206;& 148; fis , K12 et K 12 & 206;& 148; fis . Des prélèvements ont été effectués au cours de la croissance en milieu LB et les activités spécifiques & 206;& 178;-galactosidase ont été mesurées ( Figure 37 ) . Ces mesures montrent trois résultats majeurs : i ) l' activité du promoteur ompC est environ 3 fois plus élevée que celle du promoteur ompR , quelle que soit la phase de croissance  ; ii ) les deux promoteurs présentent une activité de base en phase exponentielle de croissance et sont activés d' un facteur 2 en phase stationnaire  ; iii ) aucune régulation par Fis de ces deux promoteurs n' a été observée . Des expériences de retard sur gel ont été réalisées pour analyser la fixation éventuelle de Fis sur les promoteurs ompC et ompR. Les fragments d' ADN utilisés sont les mêmes que ceux clonés pour les fusions transcriptionnelles et les conditions expérimentales ainsi que les contrôles sont les mêmes que ceux décrits précédemment ( Figure 38 ) . Les mêmes observations que dans le cas du promoteur ompF peuvent être faites : la première bande retardée est observée dès 0 , 2 nM de Fis , et la quantité d' ADN retardé , ainsi que le nombre de bandes , augmentent avec la concentration en Fis , jusqu'à 20 nM. Les constantes de dissociation calculées dans ces conditions sont d' environ 1 , 5 nM pour chacun des promoteurs , ce qui indique une forte fixation de Fis . Pour localiser avec précision les sites de fixation , des expériences d' empreintes à la DNase I ont été réalisées sur ces deux promoteurs , et ce dans les mêmes conditions que pour le promoteur ompF ( Figure 39 ) . Ces expériences ont mis en évidence des sites de fixation de Fis dans les régions régulatrices de ompR et ompC ( Figure 40 ) . La région promotrice de ompR présente cinq sites de fixation spécifique de Fis , contenant chacun une séquence proche de la séquence consensus de fixation de la protéine . Le profil de fixation de Fis est relativement atypique , avec trois différences importantes par rapport à ce qui avait été observé dans la région promotrice de ompF ( Figure 34 et 40A ) : i ) le site I recouvre le codon ATG d' initiation de la traduction de ompR  ; ii ) les sites II et III sont situés sur une séquence correspondant à la région 5 ' non traduite de l' ARNm de ompR  ; iii ) le site IV recouvre le site d' initiation majeur de la transcription . L' absence d' effet de Fis sur la transcription de ompR malgré la présence des ces sites de fixation sera abordée dans la Discussion de cette partie . De la même façon , le site V recouvre une région localisée juste en amont du codon GTG d' initiation de la traduction de greB ( Figure 40A ) . En ce qui concerne la région promotrice de ompC , le profil de fixation de Fis est similaire à celui observé pour ompR ( Figure 40B ) , avec le site I de fixation de Fis dans la région 5 ' non traduite de l' ARNm de ompC et proche du site d' initiation majeur de la transcription , T1 , le site II recouvrant la région - 35 de ce promoteur . Chacun de ces sites présente une séquence consensus de fixation de Fis . En amont de ces deux sites , une région d' environ 100 pb , appelée site III , est protégée des coupures par la DNase I , mais elle ne contient qu' une seule séquence consensus de fixation de Fis . Cette région recouvre en grande partie les sites de fixation C1 à C3 de OmpR , le site III étant localisé en amont . Régulation de ompF au cours de l' évolution expérimentale Les résultats présentés dans ce paragraphe sont préliminaires . Les protéines FIS évoluées Ara- 3 et Ara- 4 ( voir Résultats Partie II , Materials and Methods ) ont été utilisées lors d' expériences de retards sur gel avec le promoteur ompFB , dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment . Aucune fixation n' a alors été observée ( résultats non montrés ) , suggérant une absence d' activation de ompF en phase exponentielle dans les clones évolués . Ceci reste cependant à confirmer par l' analyse des fusions transcriptionnelles ompFB-lacZ dans les souches ancestrales isogéniques portant les différents allèles évolués de fis , et dans les clones évolués isolés au cours du temps dans les différentes populations d' évolution . Un premier résultat nous indique toutefois que les mutations apparues dans le gène fis résultent en une absence d' activation du promoteur ompFB par la protéine . En effet , la fusion transcriptionnelle ompFB-lacZ introduite dans 606 fis - 1 montre la même diminution d' activité par rapport à 606 que lorsqu' elle est introduite dans 606 & 206;& 148; fis ( Figure 30 ) , montrant ainsi qu' une diminution de 3 fois de la quantité de protéine a le même effet sur la transcription de ompFB qu' une absence totale de Fis . De plus , des différences de régulation au niveau de ompF se sont probablement produites au cours des 20 000 générations d' évolution expérimentale . En effet , l' estimation des quantités de OmpF par extraction des protéines membranaires et électrophorèse en gel SDS-PAGE , a révélé que les allèles fis évolués introduits dans le contexte génétique du clone ancêtre entraînaient une diminution de la quantité de OmpF. Ces allèles évolués diminuant la quantité ou l' activité de Fis , ces résultats confirment le mécanisme d' activation de Fis sur l' expression de ompF. En revanche , dans le contexte génétique des clones évolués isolés des différentes populations d' évolution , aucune diminution de la quantité de OmpF n' a été détectée malgré la présence des allèles évolués de fis . Ceci signifie que la régulation de ompF par Fis a été éliminée probablement à la suite d' autres mutations substituées dans ces populations . Ces phénomènes sont actuellement en cours d' étude . Discussion Les profils protéomiques des souches ancestrales portant les allèles ancestraux ou évolués des gènes fis et/ou topA , ont révélé que l' expression d' un certain nombre de gènes codant des protéines ancrées dans la membrane externe ( PAL , OmpA , OmpF ) , et de surA impliqué dans la régulation des protéines membranaires ( Lazar et Kolter , 1996 ) , était modifiée par la présence des allèles évolués . Nous nous sommes focalisés au cours de ce travail sur les gènes codant les porines majeures d' E. coli . Dans un premier temps , nous avons pu montrer que l' allèle évolué de topA , qui diminue l' activité de la TopoI et entraîne ainsi une augmentation de superhélicité de l' ADN , conduisait à une diminution de la transcription de ompF. Ceci avait déjà été observé chez E. coli K12 , et ce phénomène pourrait également contribuer à la répression de la transcription de ompF lors d' un choc osmotique . En effet , le stress osmotique est connu pour augmenter de façon transitoire la superhélicité de l' ADN . Nous avons pu également démontrer que la transcription de ompF chez E. coli B était dépendante d' une activation par Fis , mais uniquement au cours de la phase exponentielle de croissance . Le profil d' expression de Fis est tout à fait compatible avec cette activation , Fis étant abondante en phase exponentielle et quasiment absente en phase stationnaire . Il peut paraître surprenant que cette régulation de ompF par Fis n' ait jamais été détectée auparavant , et nous pensons que ceci est dû au fait que cette activation est spécifique d' E. coli B . Elle n' a en effet pas été observée dans une souche d' E. coli K12 . Contrairement à la situation chez E. coli B où la transcription de ompF est constitutive , la transcription de ompF chez E. coli K12 est indépendante de Fis et , après un niveau de base en phase exponentielle , elle est activée en phase stationnaire . L' absence de forte transcription de ompFK 12 en phase exponentielle pourrait être liée à l' absence d' activation par Fis . Le mécanisme permettant une activation de la transcription de ompFK 12 et le maintien d' une transcription élevée de ompFB en phase stationnaire est inconnu . Quelles pourraient être les bases moléculaires de cette différence de régulation de ompF entre E. coli B et K 12 ? L' analyse de chacune des fusions transcriptionnelles ompFB et ompFK 12 dans chacune des deux souches a révélé qu' une forte transcription en phase exponentielle ne pouvait se faire que si deux conditions étaient réunies : avoir le promoteur de ompFB et le contexte génétique d' E.   coli B . En ce qui concerne le promoteur ompFB , trois différences nucléotidiques existent par rapport à ompFK 12 ( Figure 34 ) , deux d' entre elles étant situées au sein des sites de fixation F2 et F4 de OmpR . Dans notre hypothèse , c' est la mutation située dans le site F2 , correspondant à une délétion d' un résidu T ( Figure 34 ) , qui serait un des facteurs cruciaux de la différence de régulation entre E. coli B et K12 . Toujours selon notre hypothèse , Fis serait responsable de la transcription de ompFB en phase exponentielle . Il a récemment été montré que l' activation du promoteur ompF par OmpR se faisait par un modèle « galopant » . Ces auteurs ont démontré que chaque site F1 à F4 de fixation de OmpR était divisé en deux sous-sites a et b , chacun fixant une molécule de OmpR ( Figure 41 ) . Ainsi , six molécules de OmpR au total peuvent se fixer sur les sites F1 à F3 . Le modèle « galopant » implique un ordre de fixation séquentiel , avec une première molécule de OmpR se fixant d' abord sur F 1b , ce qui permet la fixation d' une seconde molécule de OmpR sur F 1a , puis d' une troisième sur F 2b , d' une quatrième sur F 2a , etc ... ( Figure 41 ) . L' activation de ompF a lieu à partir du recouvrement des sites F1 et F2 par OmpR . Selon notre hypothèse , la délétion d' une base se produisant chez E. coli B au sein du site F 2a entraînerait un déficit de reconnaissance de ce sous-site par OmpR , ce qui bloquerait le « galop » . Notre hypothèse est que cette mutation affecterait gravement la capacité de OmpR à activer ce promoteur . Cette même délétion d' un nucléotide chez E. coli B a également pour conséquence de rapprocher la séquence du site I de fixation de Fis que nous avons déterminé ( Figure 34 ) de la séquence consensus de fixation de Fis ( 11 pb conservées sur 13 au lieu de 10 ) . Ceci améliorerait donc la capacité de liaison de Fis à cette région , et l' activation par Fis se substituerait à celle par OmpR. Cependant , nos résultats indiquent que ceci ne serait pas suffisant pour permettre l' activation du promoteur ompFB par Fis , puisque , dans le contexte génétique d' E. coli K12 , celui  -ci n' est pas activé par Fis ( Figure 36 ) . Ces résultats suggèrent en effet une régulation différentielle sur le promoteur ompFB entre E. coli B et K12 . Nous suggérons que cette différence pourrait provenir des protéines OmpR ou EnvZ elles-mêmes . En effet , de multiples modifications nucléotidiques existent pour les gènes ompR et envZ entre E. coli B et K12 , et trois d' entre elles conduisent à des changements non-synonymes d' acides aminés ; deux au niveau de OmpR ( K6N et A130T ) , et un au niveau d' EnvZ ( P41L ) . La protéine senseur EnvZ est l' histidine kinase qui phosphoryle le régulateur transcriptionnel OmpR et le résidu P41 n' est pas connu pour être impliqué dans ce processus . Les résidus K6 et A130 de OmpR ne sont pas non plus connus pour être impliqués dans l' activité de la protéine . En revanche , le résidu A130 est situé dans la région reliant les domaines N-terminal et C-terminal et permettant la flexibilité de la protéine . La protéine OmpR modifiée pourrait montrer un déficit de fixation à l' ADN qui favoriserait la liaison de Fis , qui se fixerait alors sur la région promotrice de ompFB et activerait la transcription en phase exponentielle . Ces hypothèses sont actuellement testées d' une part par des approches génétiques en introduisant les mutations ompF et ompR présentes chez E. coli B dans le chromosome d' E. coli K12 , et réciproquement . La transcription de ompF sera alors analysée dans ces différents contextes génétiques . D' autre part , des approches biochimiques pourront être utilisées , notamment par purification des protéines OmpR d' E. coli B et K12 et par des expériences de retard sur gel avec ces protéines et la protéine Fis , en utilisant les promoteurs de ompFB ou K12 . Ces différences entre les deux souches d' E. coli entraîneraient donc une expression constitutive de ompF chez E. coli B . OmpC et OmpF étant les porines majeures d' E.   coli , la perte de OmpC chez E.   coli B aurait ainsi pu être compensée par ces mutations dans le promoteur de ompF et dans ompR et envZ. Cette compensation entraînerait la régulation d' un gène de porine par Fis , qui est un régulateur central chez les bactéries , permettant l' adaptation bactérienne à de multiples conditions de l' environnement ( état nutritionnel , stress oxydatif ... ) . Enfin , nous avons également montré que Fis se fixait sur les régions promotrices des gènes ompC et ompR , sans toutefois réguler leur transcription de façon détectable . Trois hypothèses pourraient expliquer ce résultat . Tout d' abord , il est possible que les conditions testées ne soient pas celles dans lesquelles Fis intervient . Il est par exemple connu que Fis active topA , mais cela n' a pour l' instant été détecté que dans des conditions de stress oxydatif . N' ayant testé qu' une seule condition , la croissance en milieu LB , il est possible que Fis régule ces promoteurs dans d' autres conditions . La seconde hypothèse serait que la régulation par Fis ait lieu sur les gènes transcrits de façon divergente à ompC et ompR , respectivement micF et greB. Les fusions transcriptionnelles de ces régions promotrices avec lacZ ont été réalisées . La fusion contenant le promoteur de greB ne montre pas de régulation par Fis au cours de la croissance en milieu LB , et celle contenant le promoteur de micF est en cours d' étude . La troisième hypothèse serait que Fis régule ompC et ompR au niveau post-transcriptionnel . A notre connaissance , une telle fonction n' a jamais été montrée pour Fis . Cependant , la protéine Fis présente de fortes homologies avec le domaine C-terminal de NtrC ( Morett et Bork , 1998 , et Résultats , Partie II , Discussion ) , un régulateur de réponse qui fait partie d' un système à deux composants impliqués dans la réponse cellulaire aux carences en azote ( Keener et Kustu , 1988 ) . La partie C-terminale de NtrC permet sa fixation à l' ADN et donc l' activation transcriptionnelle de certains gènes . Cependant , il a aussi été montré pour cette protéine un rôle d' activateur de la traduction de NifR 3 , dont le gène est situé en amont de ntrC au sein du même opéron .. Des sites de fixation de NtrC ont été mis en évidence dans la région promotrice de nifR 3 , situés à la position - 81 et autour du + 1 de transcription , ce dernier site recouvrant également la boîte - 10 du promoteur . Les auteurs ont alors suggéré une activation de la traduction par NtrC , soit par une interaction avec l' ARN polymérase , qui ralentirait l' étape d' élongation de la transcription et favoriserait le recrutement des ribosomes et ainsi la traduction , soit par une interaction directe avec l' ARNm de nifR 3 qui favoriserait également la traduction . Cette situation correspond à celle observée pour les régions promotrices de ompR et ompC , où les sites de fixation de Fis recouvrent le + 1 de transcription de ompR ainsi que la boîte - 10 ( site IV ) . Trois autres sites se situent également entre le + 1 et l' ATG qui pourraient jouer sur la traduction de ompR ( Figure 40A ) . De même pour ompC , les sites de fixation de Fis ( Figure 40B ) recouvrent une partie de la région 5 ' non traduite , ainsi que la boîte - 35 du promoteur . Un rôle de Fis dans le contrôle de la traduction des deux protéines pourrait donc être imaginé . De plus , des interactions entre Fis et l' ARN polymérase ont été mises en évidence . Cette hypothèse est actuellement testée au laboratoire . Discussion Générale Les résultats obtenus au cours de ce travail nous ont permis de révéler l' importance du rôle joué par la superhélicité de l' ADN dans les processus évolutifs . En effet , des changements parallèles et reproductibles de superhélicité ont été mesurés à trois niveaux . Premièrement , nos résultats démontrent une association forte entre l' augmentation de superhélicité négative de l' ADN et celle du fitness . Un parallélisme phénotypique important a été mis en évidence avec une augmentation de superhélicité de l' ADN dans la majorité des populations . De plus , cette augmentation est souvent détectée pendant les 2000 premières générations , période de forte augmentation du fitness ( Lenski et Travisano , 1994 ) . Deuxièmement , ce parallélisme phénotypique s' explique par un parallélisme génétique exceptionnel : tous les gènes impliqués dans la régulation de la superhélicité de l' ADN ne sont pas la cible de la sélection naturelle , seuls trois d' entre eux le sont  : topA , fis et dusB. Bien que le mécanisme par lequel l' augmentation de superhélicité confère un avantage sélectif à ces cellules soit encore inconnu , il est probablement lié à une ou plusieurs fonctions associées aux protéines Fis , DusB et à la TopoI . Troisièmement , une forte divergence allélique est observée pour un même gène dans les différentes populations . Quatre allèles évolués différents du gène fis , isolés dans quatre populations indépendantes affectent tous les niveaux de régulation du gène : transcriptionnel , traductionnel et l' activité de liaison à l' ADN de la protéine . Malgré cette divergence au niveau mutationnel , les différents allèles conduisent à des conséquences similaires : une diminution soit de la quantité , soit de l' activité de la protéine de type histone Fis . Au cours de l' analyse de cette évolution expérimentale et des allèles évolués du gène fis , nous avons également pu mettre en évidence une nouvelle fonction de Fis : la régulation de l' expression des porines au niveau transcriptionnel chez E.   coli B , et peut-être au niveau traductionnel chez E.   coli K12 . De façon plus générale , ces travaux ont permis de montrer l' originalité et l' intérêt de ces stratégies d' évolution expérimentale . Les mutations isolées ont la particularité d' avoir été sélectionnées au cours de l' évolution bactérienne pour l' effet bénéfique qu' elles confèrent . Ceci est donc totalement différent des approches génétiques classiques où une délétion ou une modification de gènes est réalisée pour analyser leur fonction dans des environnements donnés ou en réponse à certains stress . En particulier , des fonctions nouvelles peuvent être mises en évidence , par exemple ici l' implication de Fis dans le contrôle de la composition protéique de la membrane externe ou l' implication de dusB dans les processus évolutifs , avec une connexion probable avec Fis . Une analyse plus détaillée de ces mutations est nécessaire pour caractériser ces fonctions . D' autre part , les résultats obtenus dans ce travail , ainsi que précédemment , ont permis de montrer que les stratégies d' évolution expérimentale pouvaient constituer un excellent outil de prédiction . Ceci n' est évidemment possible que par la présence de plusieurs populations indépendantes . Sur la base des séquences de gènes , il est possible de prédire par des tests statistiques lesquels peuvent être des cibles de la sélection naturelle . Nous avons d' ailleurs utilisé cet outil de prédiction afin d' analyser des mutations isolées dans le gène dusB dont la fonction n' est pas connue précisément . Nous pouvons prédire que ces mutations sont bénéfiques , et que ce gène est un bon candidat pour intervenir dans la superhélicité de l' ADN , ces prédictions étant actuellement testées expérimentalement . L' adaptation des bactéries au cours de cette stratégie d' évolution expérimentale se caractérise par deux processus fondamentaux , que nous allons maintenant discuter : le parallélisme évolutif et l' implication de la superhélicité de l' ADN et , de façon plus générale , des réseaux de régulation globale . De plus , ces travaux peuvent également soulever deux questions importantes , que nous discuterons également : par quels mécanismes une augmentation de superhélicité de l' ADN peut -elle être bénéfique  ? Qu' en est -il de la généralisation de ces phénomènes dans d' autres conditions ? Parallélisme de l' évolution Le parallélisme évolutif au cours de notre stratégie d' évolution expérimentale n' est pas observé uniquement au niveau du degré de superhélicité de l' ADN . Au niveau phénotypique tout d' abord , le fitness ainsi que le volume cellulaire augmentent de façon similaire au sein des 12 populations ( Lenski et Travisano , 1994 ; Lenski , 2004 ) . D' autre part , des diminutions , voire des pertes de fonctions cataboliques caractérisent les différentes populations . Les profils globaux de transcription et d' expression des protéines ( Pelosi et al. , 2006 ) révèlent également des changements parallèles de l' expression des gènes . D' autre part , à chaque fois que cela a été analysé , les changements phénotypiques parallèles sont associés à un parallélisme génétique , les mutations responsables des modifications étant situées dans les mêmes gènes dans la majorité des 12 populations . Ainsi , des mutations dans l' opéron rbs ( dans 12 populations ) , et les gènes malT ( 8 populations ) et spoT ( 8 populations ) sont à l' origine de réductions parallèles des capacités cataboliques et de changements parallèles d' expression des gènes . Comme dans le cas du gène fis , le parallélisme génétique s' accompagne d' une grande divergence allélique et il est fort probable qu' elle conduise également à un fort parallélisme moléculaire . Un fort degré de parallélisme a également été observé lors d' autres expériences d' évolution , y compris dans des conditions différentes ou en utilisant des organismes différents . En effet , des mutations sont sélectionnées de façon répétée au sein des mêmes gènes , et certains gènes sont même des cibles fréquentes de la sélection naturelle dans différentes stratégies d' évolution expérimentale . D' autres expériences d' évolution ont employé E. coli comme organisme modèle , en propageant ces bactéries soit dans des conditions de carences prolongées , soit dans des conditions de cultures continues en chémostat où la nourriture est apportée continuellement . Dans la première expérience , des modifications parallèles des mêmes phénotypes permettent l' adaptation aux carences . En l' occurrence , les bactéries accroissent leurs capacités à utiliser des acides aminés comme source de carbone ( Zinser et Kolter , 1999 ) . Des mutations se produisant en parallèle dans les mêmes gènes ( impliqués dans le catabolisme des acides aminés , dans rpoS codant le facteur & 207;& 131;S de la phase stationnaire ou dans lrp codant un régulateur de type histone ) sont responsables de ces changements phénotypiques . Dans des conditions de cultures continues en chémostat , des modifications parallèles au niveau du transport du glucose à travers la membrane ont été détectées dans des populations indépendantes d' E. coli ( Ferenci , 2001 ) . A nouveau , un fort parallélisme génétique en est responsable , avec notamment des mutations dans rpoS et malT . De plus , l' étude de l' évolution de souches pathogènes d' E. coli montre que les lignées anciennes ont acquis les mêmes facteurs de virulence de façon indépendante et parallèle , incluant un îlot de pathogénicité ainsi que des gènes de toxines . D' autres expériences d' évolution ont utilisé d' autres organismes qu' E. coli , et le parallélisme phénotypique et génétique de l' évolution a été retrouvé à tous les niveaux de complexité des organismes : depuis des lignées indépendantes de virus adaptées à des températures élevées , où la moitié des substitutions nucléotidiques sont identiques , en passant par des populations indépendantes de levure adaptées à des transitions glucose-galactose dans lesquelles le même gène répresseur de la voie d' utilisation du galactose a été désactivé , jusqu'à des poissons vivants dans des lacs différents où des modifications parallèles de phénotypes ( métabolisme énergétique et déplacement ) sont dues à un parallélisme génétique ( augmentation de l' expression des gènes codant la crystalline-& 206;& 179; et la parvalbumine-& 206;& 178; notamment ) . Dans ce dernier cas , il ne s' agit plus d' évolution expérimentale , mais d' études réalisées dans des environnements naturels . De telles conclusions ont également été obtenues pour d' autres eucaryotes , comme par exemple la drosophile . Le parallélisme est donc un point commun à tous les types d' évolutions , en laboratoire ou dans la nature . Les systèmes d' évolution expérimentale sont donc des outils tout à fait appropriés pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l' adaptation d' un organisme à un environnement donné . Plasticité des réseaux de régulation globale Toutes les mutations conférant une augmentation du fitness , et mises en évidence à ce jour dans la stratégie d' évolution expérimentale , affectent les gènes ou opérons suivants : rbs , spoT , topA , fis , dusB ( ce travail ) , malT , nadR , pbpA-rodA , pykF , hokB-sokB . Près d' un tiers de ces gènes ( topA , fis , spoT ) codent des régulateurs globaux de l' expression des gènes , intervenant dans deux des plus importants réseaux de régulation génétique : la superhélicité de l' ADN et la réponse stringente . La plasticité des réseaux de régulation globale est donc un paramètre crucial permettant l' adaptation des bactéries à leur environnement . Au sein de la population modèle Ara- 1 , les mutations substituées dans les gènes topA et spoT apparaissent très tôt ( avant 500 et 1500 générations , respectivement ) et confèrent les augmentations de fitness les plus importantes identifiées à ce jour ( 13 % et 10 % , respectivement ) . La modification de ces deux réseaux de régulation fondamentaux de la cellule doit forcément engendrer des effets pleïotropes , et il est improbable que tous ces effets soient bénéfiques . Certains d' entre eux sont sans doute neutres , voire faiblement néfastes , mais compensés par des effets bénéfiques plus importants . Il est alors possible d' imaginer qu' une fois ces mutations fixées , la cellule puisse continuer à s' adapter en compensant les effets néfastes par d' autres mutations plus tardives . Un tel effet de compensation pourrait expliquer le bénéfice conféré par les mutations du gène fis , dont nous avons démontré qu' elles provoquaient une diminution de la quantité ou de l' activité de Fis . En effet , nous avons observé une augmentation de la quantité de Fis chez des clones évolués isolés à 2000 générations , c' est-à-dire avant l' apparition des mutations dans fis . Cette augmentation de la quantité de Fis pourrait être néfaste et être liée à une autre mutation fixée avant 2000 générations . Ainsi , les mutations fis , toutes fixées vers 10 000 générations , permettraient de compenser ce « défaut » . Pour essayer de confirmer cette hypothèse , nous avons introduit par recombinaison homologue dans le chromosome de la souche ancêtre une mutation affectant la boîte - 35 du promoteur de fis ( le résidu T en position - 34 est modifié en G ) et résultant en une augmentation de 18 fois de la transcription de fis ( Walker et al. , 1999 ) . Nous avons vérifié cette augmentation par Western blot et mesuré le fitness de cette souche par des expériences de compétitions , qui ont révélé une diminution de fitness . Ainsi , les mutations fis pourraient compenser les effets néfastes liés à une augmentation de Fis en diminuant la concentration ou l' activité de Fis . Un tel phénomène de compensation d' effets pleïotropes a été observé dans une autre étude d' évolution expérimentale , au cours de laquelle 7 populations indépendantes d' E. coli ont été adaptées pendant 600 à 1000 générations à deux conditions différentes : du milieu minimum contenant du glycérol ou du lactate comme seule source de carbone . L' analyse du profil de transcription de ces 14 populations au cours de l' évolution révèle que l' expression de nombreux gènes est modifiée en début d' expérience en réponse aux nouvelles conditions de croissance . Ceci est rapidement suivi d' un retour de l' expression de la plupart de ces gènes au niveau initial . Ainsi , un ensemble relativement restreint de gènes est exprimé différentiellement dans les clones évolués par rapport à l' ancêtre , et un nombre important de changements compensatoires d' expression des gènes est observé au cours de l' évolution . La plasticité des réseaux de régulation est également visible chez les isolats naturels . En effet , l' étude de 41 isolats cliniques de Salmonella sérotype Typhi montre que 15 isolats présentent des mutations de types insertions , délétions et mutations non-sens dans le gène rpoS , codant le facteur & 207;& 131;S de réponse aux stress ( Hengge-Aronis , 2002 ) requis pour la virulence chez la souris . Ce régulateur est également très variable chez différents isolats naturels d' E. coli qui présentent une variation de l' activité de RpoS corrélée avec des différences de résistance à la pression osmotique . Les isolats de laboratoire et naturels d' E. coli présentent des niveaux relatifs différents des deux facteurs sigma RpoS et RpoD , ce qui affecte la transcription globale et aboutit à une variabilité des capacités métaboliques et de résistance à divers stress . Ces deux facteurs sigma entrent en compétition pour la liaison à l' ARN polymérase , la liaison de RpoD améliorant la croissance , celle de RpoS favorisant la résistance aux stress . La modification de ce réseau de régulation majeur dont le pivot est RpoS permet donc l' adaptation à des environnements différents . La complexité et la plasticité des réseaux de régulation pourraient ainsi avoir été sélectionnées au cours de l' évolution , de par leur capacité à accroître le spectre évolutif des organismes . Dans notre expérience d' évolution , la plasticité des réseaux de régulation permet une adaptation rapide par de grandes modifications de l' expression des gènes , puis les effets bénéfiques sont conservés , et les effets néfastes seraient compensés par des mutations ultérieures . Ceci constitue non seulement un premier indice sur le mécanisme d' adaptation des bactéries à leur environnement , mais aussi un phénotype supplémentaire révélant une évolution parallèle au sein des 12 populations . Les mécanismes moléculaires de l' adaptation Au cours de l' évolution expérimentale , deux catégories de mutations bénéfiques ont été sélectionnées . La première touche des gènes de structure ou des régulateurs d' un petit nombre de gènes , ce qui conduit à des phénotypes relativement clairs et évidents . Par exemple , les délétions de l' opéron rbs provoquent la perte de la capacité à utiliser le ribose , et les mutations dans le gène malT diminuent la capacité des bactéries à utiliser le maltose comme source de carbone . La deuxième catégorie de mutations affecte des gènes de régulation globale , comme la superhélicité de l' ADN ou la réponse stringente . Les effets de ces mutations sont beaucoup plus difficiles à appréhender , pour plusieurs raisons . Tout d' abord , les effets pleïotropes de ces mutations peuvent rendre les effets bénéfiques majeurs difficiles à caractériser . Ensuite , les mutations sélectionnées ont des effets subtils . En effet , elles ne correspondent pas à des délétions ou des inactivations de fonction , mais entraînent des variations plus faibles : par exemple , les mutations du gène fis dans les populations Ara- 1 et Ara + 1 diminuent la quantité de protéine de 3 fois . De plus , les travaux effectués au cours de cette thèse et de celle de N. Philippe ( Philippe , 2006 ) suggèrent que le bénéfice apporté par les mutations isolées n' est pas directement lié aux fonctions connues de ces gènes . Par exemple , les mutations bénéfiques affectant le gène spoT , codant une des protéines majeures responsable du métabolisme ( synthèse et dégradation ) de ( p ) ppGpp , l' effecteur de la réponse stringente ( Cashel et al. , 1996 ) , ne modifient aucunement son niveau dans la cellule , ni ses taux de synthèse ou de dégradation ( Philippe , Crozat , Lenski et Schneider , manuscrit en préparation ) . De même , Fis étant connue pour réprimer la transcription des gènes codant la gyrase , la diminution de quantité ou d' activité de Fis observée au cours de l' évolution pourrait conduire à une augmentation de la quantité de gyrase , ce qui permettrait d' expliquer la seconde augmentation de superhélicité observée à 20 000 générations dans la population Ara- 1 . Cependant , les expériences de Western blot effectuées n' ont pas permis de détecter une telle modification suite aux mutations du gène fis ( résultats non montrés ) . L' augmentation de superhélicité de l' ADN pourrait être bénéfique par augmentation de la transcription des ARN stables qui est dépendante d' un niveau élevé de superhélicité négative . Ceci permettrait alors une croissance plus rapide et pourrait ainsi conduire à une augmentation du fitness . Cependant , des fusions transcriptionnelles entre le promoteur P1 de l' opéron d' ARN ribosomiques rrnB avec le gène rapporteur lacZ , introduites dans le chromosome des souches ancestrales isogéniques 606 , 606 fis - 1 , 606 topA - 1 , et 606 topA - 1 fis - 1 , n' ont révélé aucune différence significative dans l' expression de ce promoteur . Nous avons également quantifié les contenus cellulaires en ADN , ARN et protéines de ces quatre souches , ce qui n' a également révélé aucune différence . Le bénéfice conféré par les mutations fis et topA ne réside donc pas dans une différence phénotypique évidente . La superhélicité de l' ADN est connue pour favoriser la transcription de gènes nécessaires à la croissance , comme les opérons d' ARN ribosomiques , notamment lors de l' initiation de la transcription . Ces gènes sont caractérisés par la présence d' un discriminateur riche en GC situé entre la boîte - 10 du promoteur et le site + 1 d' initiation de la transcription . Ce discriminateur constitue une barrière énergétique qu' il faut surmonter pour l' initiation de la transcription de ces gènes . L' augmentation de superhélicité pourrait ainsi améliorer le taux d' initiation de la transcription de certains de ces gènes . Ceci pourrait conférer un avantage sélectif important d' une part au niveau de la phase de croissance , mais aussi à la reprise de la croissance lors des transferts journaliers des cellules dans du milieu frais . Nous avons montré que le bénéfice apporté par une augmentation de la superhélicité de l' ADN était associé à des mutations apparues non pas dans l' ensemble des gènes régulant la superhélicité , mais spécifiquement dans topA , fis et dusB. Ainsi , des fonctions spécifiques de ces trois gènes pourraient avoir été soumises à pression de sélection au cours de cette évolution expérimentale . Les allèles évolués des gènes topA et fis pourraient entraîner des modifications du profil d' expression globale , dont certaines pourraient conférer une augmentation du fitness . En effet , des mutations du gène topA sont connues pour affecter les profils protéomiques chez les bactéries , et Fis est connue pour réguler la transcription d' un grand nombre de gènes . Nous avons démontré au cours de ces travaux que les mutations bénéfiques dans topA et fis provoquaient une diminution de l' activité de la TopoI ainsi que de Fis . En ce qui concerne Fis , elle est capable de se fixer de façon spécifique sur des sites à haute affinité , mais également de manière aspécifique . De plus , l' affinité de Fis pour ses différents sites de fixation est très variable ( Muskhelishvili et Travers , 2003 ) . La diminution de la quantité ou de l' activité de Fis ne pourrait donc affecter qu' un certain nombre de sites à plus faible affinité et de ce fait ne modifier la transcription que de cette catégorie de gènes dépendants de Fis . La transcription des gènes d' opérons d' ARN ribosomiques ne serait ainsi pas affectée . Enfin , le bénéfice apporté par ces mutations pourrait être lié à un effet sur la structure globale du chromosome . En effet , Fis est impliquée dans la formation de domaines topologiques et constitue une barrière à ces domaines ( Hardy et Cozzarelli , 2005 ) . La diminution de quantité ou d' activité de liaison à l' ADN de Fis pourrait diminuer le nombre de barrières topologiques et , dans les conditions de l' évolution expérimentale , ceci pourrait avoir un effet bénéfique en accélérant les processus de réplication du chromosome en limitant les pauses du complexe de réplication dues à la présence de ces barrières . L' augmentation de superhélicité de l' ADN via les allèles évolués de topA pourrait également favoriser une structure chromosomique permettant une meilleure ségrégation des chromosomes-fils au moment de la division cellulaire . En effet , lors d' une augmentation de superhélicité , l' efficacité de décaténation des chromosomes-fils augmente de manière exponentielle avec la longueur de l' ADN . La superhélicité de l' ADN dans la nature Nous avons observé une augmentation systématique de la superhélicité dans 10 des 12 populations d' évolution , ces modifications étant bénéfiques dans ces conditions . Afin d' étendre ces résultats à d' autres environnements , des expériences de compétitions ont été réalisées dans différents milieux avec les souches ancêtres portant les allèles évolués de fis et topA identifiés dans la population Ara- 1 ( Résultats Partie II ) . Quelles que soient les conditions ( milieu riche , source de carbone différente ou basse température ) , les deux mutations se sont révélées bénéfiques . Il semblerait donc qu' une augmentation de superhélicité soit bénéfique dans une grande variété d' environnements . Les bactéries , dans leur environnement naturel , sont confrontées à des fluctuations des conditions externes ( carences nutritionnelles , apports nutritifs , stress de température , oxydatif , osmotique ... ) . Cela se traduit par une forte diversité des réseaux de régulation dans les isolats naturels , par exemple des niveaux relatifs de RpoS et RpoD , ce qui conduit alors à des compromis évolutifs entre croissance et survie . L' implication évidente de la superhélicité de l' ADN dans les processus évolutifs pourrait se traduire de la même façon dans les isolats naturels par un polymorphisme important du niveau de superhélicité . Cela permettrait alors des compromis évolutifs et une adaptation appropriée à différents types d' environnements . Perspectives Le but principal de cette expérience d' évolution en laboratoire étant de comprendre les mécanismes d' adaptation des bactéries à leur environnement , il est crucial de disséquer les différentes étapes de l' évolution , en essayant de comprendre les effets des différentes mutations bénéfiques les unes par rapport aux autres . L' histoire évolutive d' une population peut notamment être reconstruite . Par exemple dans notre population modèle , une dizaine de mutations conférant une augmentation du fitness ont été caractérisées . Un des projets du laboratoire est de les introduire une par une , dans leur ordre d' apparition , dans la souche ancêtre , et en parallèle , d' introduire chacune de ces mutations séparément dans l' ancêtre . Leur effet pourra alors être analysé à deux niveaux : dans le contexte génétique de l' ancêtre , et dans le contexte génétique où elle est apparue . Dans le cas particulier des mutations fis et topA , l' étude de leurs effets sur les domaines topologiques et la mise en place de barrières de ces domaines devrait être envisagée . Ceci pourrait par exemple se faire de deux façons , qui ont été décrites dans l' introduction , soit par l' étude des événements de recombinaison entre sites res , soit par l' étude du profil de transcription de gènes sensibles à la superhélicité avant et après coupure du chromosome par une enzyme de restriction . L' effet des mutations fis et topA sur la réplication et la ségrégation des chromosomes pourrait également être étudié . Concernant la protéine Fis , son rôle sur l' expression des porines reste à élucider , en tentant par exemple d' identifier les conditions dans lesquelles cette protéine régule les gènes ompF , ompC et ompR chez E. coli K12 , ainsi qu' un rôle éventuel dans la traduction des ARNm . La seconde découverte liée à Fis est son rôle commun potentiel avec DusB. La construction d' une des mutations isolées dans le gène dusB est en cours , et son rôle sur le fitness et la superhélicité de l' ADN sera étudié . De futures études pourraient également porter sur l' influence des mutations localisées dans dusB sur la traduction de l' ARNm de fis . Enfin , la topologie de l' ADN dans des isolats naturels pourrait être étudiée , afin tout d' abord de voir comment le niveau de superhélicité varie entre différents isolats , et ensuite de tester si une augmentation de superhélicité serait bénéfique , dans des isolats pathogènes ou dans différentes conditions de croissance par exemple . 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Les topoisomérases de type IB ( en bleu ) sont capables de laisser le brin d' ADN clivé effectuer une rotation autour du brin non clivé , modifiant Lk de plusieurs unités , positivement ou négativement . Les topoisomérases de type II ( en vert ) transfèrent une hélice à travers une autre hélice , changeant Lk par étapes de 2 . Figure 2 : Mécanisme d' action d' une topoisomérase de type IIA ( Corbett et Berger , 2004 ) Les différents domaines sont colorés comme suit : en vert , le domaine 5Y-CAP , en rouge , le domaine toprim , en jaune , les domaines GHKL et transducteur , les hélices d' ADN étant matérialisées en rose ( hélice G ) et bleu ( hélice T ) . Un premier segment d' ADN est d' abord lié ( hélice G ) puis l' entrée du deuxième entraîne la dimérisation des domaines GHKL . Les molécules d' ATP ( étoiles ) sont alors hydrolysées et le changement conformationnel qui s' en suit amène à la coupure de la première hélice d' ADN et au transfert de la seconde dans les « portes » ( bleu foncé ) , qui s' ouvrent enfin pour libérer l' hélice T . Figure 3 : Structure d' une Topo de type IA ( Corbett et Berger , 2004 ) La structure de la TopoIII d' E. coli , très similaire à celle de la TopoI , est montrée ici . Les différents domaines conférant leur activité aux topoisomérases de type IA sont colorés comme suit : en vert , le domain 5Y-CAP   ; en bleu , le domaine de type CAP , similaire au 5Y-CAP mais sans la tyrosine catalytique et en rouge le domaine toprim . L' enzyme adopte une forme toroïdale . Figure 4 : Mécanisme d' action de la TopoI ( Perry et Mondragon , 2003 ) Les différentes étapes du relâchement de l' ADN par la TopoI sont montrées ici . L' enzyme est schématisée en gris avec le site d' interaction avec l' ADN en jaune et la double hélice d' ADN en bleu et rouge . Pour le détail des étapes , voir texte . Figure 5 : Modèle de Liu et Wang ( 1987 ) et boucles R ( Drolet , 2006 ) A . Modèle de Liu et Wang . En ( a ) , une machinerie transcriptionnelle ( R ) , incluant l' ARN polymérase , l' ARN synthétisé et des protéines liées à cet ARN , est représentée , progressant suivant la direction de la flèche . Les extrémités de l' ADN sont ancrées à une structure plus large schématisée par les barres verticales , représentant ainsi un domaine topologique . ( b ) Une autre vue de cette machinerie , schématisée comme un séparateur au sein de l' hélice d' ADN . ( c ) Quand R se déplace de gauche à droite , l' ADN devient superenroulé positivement en amont et superenroulé négativement en aval . B . Schéma de formation de boucles R ( Drolet , 2006 ) . Les boucles R peuvent apparaître dans certaines conditions ( ADN hyper enroulé , basse température ) . Ces boucles sont formées par l' hybridation de l' ARN nouvellement synthétisé avec l' ADN matrice , et empêche ainsi la réhybridation de la double hélice d' ADN . Ces structures peuvent soit empêcher la transcription en bloquant l' ARN polymérase , soit inhiber la traduction de nouvelles protéines par la dégradation de l' ARNm hybridé à l' ADN . Figure 6 : Les différents domaines des topoisomérases de type IIA ( Schoeffler et Berger , 2005 ) Les domaines GHKL formant l' ATPase sont montrés en jaune avec en orange les domaines transducteurs ; la «  porte  » est formée par deux domaines 5Y-CAP en vert , et les deux domaines toprim toprim aidant au clivage de l' ADN en rouge . Les domaines formant les « C-gate » sont montrés en bleu foncé et les domaines C-terminaux en violet . Figure 7 : Mécanisme d' action des ToposII , ici de la gyrase ( 1 ) Un segment d' ADN se lie à la sous-unité GyrB ( en jaune ) . Les domaines C-terminaux des sous-unités GyrA ( en rouge ) le lient et l' enroulent de façon à présenter une des extrémités de la même hélice aux sous-unités GyrB ( segment T ) ( 2 , et vue de dessus ) . Elle est capturée par la dimérisation des domaines ATPase ( étoile noire ) en conformation de supertour positif , et son passage dans le domaine N-terminal des sous-unités GyrA ( en bleu ) induit la formation de 2 supertours négatifs ( 3 ) . Le segment G est ensuite libéré en même temps que deux molécules d' ADP et de Pi . Figure 8 : Rôle de la sous-unité GyrA de la gyrase d' E . coli dans la modification de la superhélicité de l' ADN A . Les domaines N-terminaux d' un dimère de sous-unités GyrA ( résidus 30 à 522 ) sont montrés ici en bleu , et les domaines C-terminaux en rouge ( résidus 535 à 841 ) . La distance maximale séparant les domaines NTD et CTD est de 39 Å ; cette distance pourrait permettre la mobilité des extrémités C-terminales , entraînant le transfert de l' hélice T et la diminution du paramètre Lk par incréments de 2 . B . Différence entre les CTD de GyrA de la gyrase ( à gauche , en bleu ) et les CTD de ParC de la TopoIV ( à droite , en bleu ) . Les sous-unités GyrB et ParE sont représentées en jaune , à gauche et à droite , respectivement . En ce qui concerne la gyrase ( à gauche ) , l' ADN est enroulé autour des CTD de GyrA , et un mouvement de l' un deux provoquerait le transfert de la double hélice T dans la cavité formée par les portes C. La fixation de l' ADN autour des CTD de ParC ( à droite ) serait moins forte , ou bien leur mouvement serait moins coordonné . Ils présentent néanmoins une double hélice courbée dont la conformation est prévalente dans les caténanes , qui forment le substrat majeur de la TopoIV ( Schoeffler et Berger , 2005 ) . Figure 9 : Effets sur l' ADN de la protéine H-NS A gauche , modèles représentant les dimères de H-NS sous leur forme active . Au centre , image par microscopie à force atomique montrant un plasmide incubé avec la protéine H-NS . A droite , différentes structures formées par H-NS fixée à l' ADN . Figure 10 : Mécanisme de répression de la transcription par H-NS L' ARN polymérase est représentée en bleu et H-NS en rouge . ( i ) Liaison de l' ARN polymérase sur un promoteur flanqué de régions courbées . ( ii ) Enroulement de l' ADN autour de l' ARN polymérase , ce qui rapproche les courbures intrinsèques de l' ADN . ( iii ) La fixation de plusieurs molécules de H-NS sur ses sites entraîne le blocage de l' ARN polymérase . ( iv ) Le complexe formé par H-NS est séparé par un changement de l' environnement ou l' intervention de facteurs de transcription . Figure 11 : Effet sur l' ADN des protéines courbant l' ADN A , IHF ; B , HU ; C , Fis . A gauche , modèles représentant les oligomères liés à l' ADN . Au centre , image par microscopie à force atomique , montrant un plasmide incubé avec la protéine . A droite , modèles de liaison des protéines ( en rouge ) à deux hélices d' ADN ( en bleu ) . Pour HU , on observe 2 formes de fixation à l' ADN : en faible concentration , HU courbe l' ADN  ; à hautes concentrations , il forme des filaments rigides . Figure 12 : Effet antagoniste de HU et H-NS sur un plasmide ( Dame et Goosen , 2002 ) A gauche , le plasmide pUC 19 est incubé avec HU ( 1 dimère / 9 pb ) ; au centre , le plasmide pUC 19 relâché  ; à droite , le plasmide pUC 19 incubé avec H-NS ( 1 dimère / 12 pb ) . Figure 13 : Protection de l' ADN par Dps A gauche , modèle représentant les 12 monomères formant une sphère . Au centre , image par microscopie à force atomique montrant de l' ADN incubé avec Dps . A droite , modèle de protection de l' ADN ( en rouge ) par des dodécamères associés entre eux ( en bleu ) . Figure 14 : Effet de la protéine Fis sur la structure du nucléoïde et la transcription ( Dorman et Deighan , 2003 ) Fis agit sur l' ADN à deux niveaux : global ( sphères oranges ) , en favorisant la formation de domaines topologiques et de boucles , et local ( sphères vertes ) , en courbant l' ADN au niveau des promoteurs , ce qui favorise la transcription par interaction avec l' ARN polymérase . Figure 15 : Structure d' un dimère de Fis A . Modèle d' un dimère de Fis . Les structures des cristaux obtenus à partir de la protéine Fis sauvage ( résidus 26 à 98 ) et d' un mutant K36E ( résidus 10 à 25 ) ont été combinées pour donner un modèle plus complet . Les résidus 26 à 98 ( bleu et rouge plus clairs ) forment 4 hélices A à D ( résidus 26 à 98 ) et A'à D' ( résidus 126 à 198 ) . Les résidus 10 à 25 forment deux feuillets ß arrangés en épingle à cheveux . Les résidus 68 à 74 montrés sont ceux impliqués dans l' interaction avec l' ARN polymérase sur les promoteurs rr B P1 ou proP P2 . B . Modèle représentant la surface de Fis en interaction avec l' ADN , courbé . Les résidus 68 à 74 sont montrés en couleur . Figure 16 : Régulation du promoteur de fis Les séquences encadrées sont les régions - 35 , - 10 et le site majeur d' initiation de la transcription , au dessus duquel une flèche en gras souligne la force de ce site . La séquence discriminatrice riche en G-C et la région riche en A sont soulignées ; les bases marquées d' un point sont importantes pour l' activité du promoteur . Les flèches pleines indiquent les régions nécessaires à la régulation par la réponse stringente et au cours de la phase de croissance ; celles en pointillés indiquent des régions avec des effets mineurs dans l' un ou l' autre des processus . La connexion avec la concentration en CTP est aussi mise en valeur . Figure 17 : Complémentarité entre l' ARNr 16S et l' extrémité 5 ' non traduite de l' ARNm fis Les conformations prédites de l' extrémité 3 ' de l' ARNr 16S sont représentées en absence ou en présence de l' ARNm de fis ( en gris ) . Le codon d' initiation de la traduction est souligné . Une interaction particulièrement forte existe entre l' extrémité 3 ' de l' ARNr 16S et l' ARNm de fis . Celle  -ci empêcherait , en absence de BipA , le démarrage de la traduction . Figure 18 : Région promotrice de rrnB Pour chacun des deux promoteurs , le + 1 de transcription , les boîtes - 10 et - 35 , les séquences en amont ( UP elements ) et les sites de fixation de Fis sont indiqués . Figure 19 : Modèle d' interaction de Fis avec l' ARN polymérase sur le promoteur rr B P1 La transcription est majoritairement activée par la fixation de Fis sur le site I , centré à - 71 . Les deux CTD des sous-unités & 206;& 177; se lient à l' ADN , l' un en contact avec Fis et l' autre sur l' élément en amont du promoteur ( UP ) . Figure 20 : Système de recombinaison par Hin Hin ( en gris ) se fixe aux sites de recombinaison hixL et hixR ( a ) , et Fis ( en jaune ) se lie aux deux domaines « enhancer » sur un substrat superenroulé ( b ) . Le complexe d' inversion est assemblé avec l' aide de HU ( c ) . En d , le fragment d' ADN entre hixL et hixR a été inversé . Figure 21 : Types de structures formées par MukB En haut , les deux formes prises par le dimère ( forme en V ou anneau ) sont montrées . Au milieu , la formation d' une fibre intermoléculaire , et en bas une structure en rosette sont schématisées . Un modèle de compaction de l' ADN ( en gris ) par les protéines de type SMC ( en bleu et jaune ) , est montré en bas à droite . L' ADN , comme les protéines SMC , prend alors une structure de type rosette . Figure 22 : Système rapporteur sensible à la superhélicité de l' ADN Représentation de la cassette topologique utilisée dans cette étude . L' « inducteur de superenroulement » , formé d' un promoteur inductible et du gène rapporteur uidA est situé en amont du « rapporteur de superhélicité » , formé d' un promoteur sensible au superenroulement , gyrA , fusionné à un second gène rapporteur , lacZ. Les deux éléments sont séparés par un terminateur fort de la transcription ( épingle à cheveux ) . Figure 23 : Modèle de compaction du chromosome par H-NS et Fis A .  Modèle de condensation de l' ADN par H-NS . Des dimères d' H-NS ( formes ovales ) se fixent et polymérisent sur une molécule d' ADN . Quand deux brins d' ADN portant des molécules d' H-NS sont suffisamment proches , les protéines peuvent interagir avec l' autre brin d' ADN , ou entre elles ( voir structure de la Figure 9 ) , formant ainsi un pontage . Cette réaction est coopérative , la formation des premiers pontages entraînant de nouvelles interactions dans les « bulles » laissées libres . L' oligomérisation de H-NS crée un second niveau de condensation ( en bas ) . B . Modèle de réarrangement de l' ADN par Fis . La fixation et la courbure de l' ADN par des dimères de Fis ( en jaune ) facilitent les structures formant des branches et des boucles dans l' ADN . Notons que cette réorganisation permet de rapprocher des sites à priori éloignés ( en bleu ) . Figure 24 : Structure des macrodomaines d' E. coli et leur réponse à la topologie de l' ADN ( Travers et Muskhelishvili , 2005 ) Les macrodomaines ( cercle interne ) sont représentés d' après Valens et al. ( 2004 ) : en vert , le macrodomaine entourant oriC   ( Ori , l' origine de réplication ) , en rouge , celui entourant ter ( Ter , le terminus de réplication ) , en bleu les autres domaines cartographiés , séparés du domaine de oriC par des régions moins définies , en pointillés . Les régions de gènes dont la transcription répond globalement à la superhélicité sont montrées en dehors du chromosome ( s / h dependence ) . En vert , les gènes répondant à un superenroulement négatif ; en rouge , ceux répondant à un relâchement . Une région riche en sites de fixation de Fis proche de ter est montrée ( fis clusters ) , et celle d' activité transcriptionnelle intense en période de croissance rapide , en gris . Figure 25 : Réorganisation du chromosome en fonction des conditions de croissance ( Travers et Muskhelishvili , 2005 ) Les structures du chromosome formées dans des cellules en phase exponentielle de croissance indiquent que l' organisation des boucles et des sites de transcription dépend fortement du taux de croissance de la cellule . Dans ces conditions de croissance , la structure globale est une forme circulaire ouverte mais des connections intramoléculaires sont possibles , et celles  -ci dépendent fortement de l' environnement dans lequel se trouve la cellule . Les structures formées en phase stationnaire sont basées sur une visualisation en microscopie électronique . En début de phase stationnaire , on observe des structures toroïdales , qui deviennent cristallines en phase stationnaire prolongée , notamment sous l' action de Dps ( voir paragraphe I.B. 1 ) . Figure 26 : Boucle de régulation homéostatique de la superhélicité de l' ADN Les effets positifs sont représentés par des flèches , les inhibitions par des lignes terminées par un trait perpendiculaire . Deux boucles d' autorégulation sont ainsi reliées . L' ajout de nutriments pourrait activer directement la gyrase en augmentant le rapport [ ATP ] / [ ADP ] . La transcription de fis est ainsi activée par l' augmentation de superhélicité , de la concentration en CTP et par la levée du contrôle stringent sur fisP. Voir texte pour les détails . Figure 27 : Détermination du fitness de clones évolués par des expériences de compétitions Un clone évolué et l' ancêtre de marqueur Ara opposé sont adaptés pendant 24h au milieu dans lequel le fitness doit être déterminé , le plus souvent du DM25 . Des volumes identiques de ces cultures sont ensuite utilisés pour inoculer une même culture . A l' instant du mélange ( t = 0 ) , un prélèvement est effectué et une dilution adéquate est étalée sur un milieu contenant du tétrazolium et de l' arabinose ( TA ) . Les clones des populations Ara + y apparaîtront roses , alors que ceux des populations Ara- y apparaîtront rouges . Après 24h , un deuxième prélèvement est effectué et étalé sur TA . Les colonies des deux compétiteurs sont alors dénombrées ( D ) et le taux de croissance de chaque compétiteur calculé . Le fitness W du clone évolué ( e ) est le rapport du taux de croissance de ce clone sur le taux de croissance de l' ancêtre ( a ) . Fitness clone évolué / clone ancêtre :