_: Année 1999 N° 237 - 99 THESE présentée devant L' UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON I pour l' obtention du DIPLOME DE DOCTORAT ( arrêté du 30 mars 1992 ) présentée et soutenue publiquement le 23 NOVEMBRE 1999 par Eric DANNAOUI Etude de la résistance d' Aspergillus spp. spp. à l' amphotéricine B et à l' itraconazole . Jury : Monsieur le Pr . S. PICOT ( Lyon ) Monsieur le Pr . J.M . BASTIDE ( Montpellier ) Monsieur le Pr . D . CHABASSE ( Angers ) Madame le Pr . R. GRILLOT ( Grenoble ) Madame le Dr . F . PERSAT ( Lyon ) Résumé Les infections aspergillaires invasives sont des maladies sévères dont la fréquence a récemment augmenté et pour lesquelles le traitement reste limité à deux antifongiques , l' itraconazole ( ITZ ) et l' amphotéricine B ( AMB ) . Le but de notre travail était de rechercher in vitro des résistances à ces antifongiques , de confirmer ces résistances in vivo chez l' animal , et d' aborder les mécanismes à l' origine de ces résistances . La réalisation de tests in vitro a permis de comparer la sensibilité relative des principales espèces d' Aspergillus spp. spp. à l' AMB et à l' ITZ et de détecter des souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ . Les techniques de détermination des concentrations minimales inhibitrices in vitro pour les champignons filamenteux étant encore mal standardisées , nous avons également tenté d' apporter des améliorations pour la réalisation de ces tests . Pour confirmer les résistances détectées in vitro , un premier modèle animal d' aspergillose pulmonaire invasive chez la souris immunodéprimée a été utilisé mais s' est avéré inadapté . En revanche , l' utilisation d' un autre modèle , réalisant une aspergillose disséminée chez la souris immunocompétente a permis de clairement confirmer la résistance à l' ITZ détectée in vitro de souches d' A. fumigatus . Si certaines souches d' A. fumigatus semblent naturellement résistantes à l' ITZ , nous avons pu montrer également que A. fumigatus pouvait acquérir une résistance à cet antifongique lors d' un traitement au long cours . Parmi les autres espèces d' Aspergillus , A . terreus est une espèce émergente responsable d' infections difficiles à traiter . Nous avons pu montrer chez l' animal , qu' une souche d' A. terreus était très résistante à l' AMB in vivo , mais que cette résistance était non détectable in vitro . Enfin , nous avons réalisé une étude biochimique de différentes souches d' A. fumigatus et montré que la résistance à l' ITZ n' était pas liée , pour les souches étudiées , à une modification qualitative ou quantitative des stérols membranaires . Amphotericin B and itraconazole resistance of Aspergillus spp. spp. Summary The incidence of invasive Aspergillus infections has recently increased , and amphotericin B ( AMB ) and itraconazole ( ITZ ) are currently the only available drugs . The aim of our study was to detect the resistance to these two antifungals in vitro , to confirm the resistance in vivo using an animal model , and to examined the possible mechanism responsible for resistance . A comparison of the in vitro susceptibility of the major Aspergillus species against AMB and ITZ was performed and A. fumigatus isolates resistant to ITZ were detected . As methods for in vitro susceptibility testing of mold are currently not well standardized we tried to improve the technical procedures for these tests . In order to confirm the in vitro detected resistance we used an animal model of pulmonary invasive aspergillosis , but this model in immunocompromised mice was not useful . An other model of disseminated aspergillosis in non immunocompromised mice was then used and allowed to confirm the in vitro - detected resistance to ITZ of A. fumigatus isolates . If de novo to ITZ of A. fumigatus seems to occured , we also demonstrated that acquisition of resistance during prolonged ITZ therapy could appeared . Among other Aspergillus species , A . terreus is an emerging pathogen responsible for infections which are difficult to treat . We showed that an isolate of A. terreus was highly resistant to AMB in vivo . Nevertheless , the resistance was not detected in vitro . We have realised a biochemical study of different A. fumigatus isolates and showed that ITZ resistance was not related to qualitative or quantitative modifications of membrane sterols . Mots  -clés : Aspergillus spp. , résistance aux antifongiques , modèles animaux Adresse : Laboratoire de Parasitologie , Mycologie Médicale et Pathologie Exotique , Université Claude Bernard Lyon I. 8 avenue Rockefeller . 69373 Lyon Cedex . France . It's time to write some fungal verses Of moulds and yeasts and their dreaded curses . I hope the reader will become well aware Of Aspergillus , and what it brings to bear . The third is invasive and quite opportunistic . If immunity's low , don't be optimistic . Most of the patients have white counts too low , They've had transplants or steroids or toxic chemo . And so through the bloodstream the fungus can spread : To the parts of the body , including the head . And the treatment of choice is considered unbearable ; Adjudged by its moniker , amphoterrible . Barranco C.P . Aspergillus and its place in medical mycology Journal of Medical and Veterinary Mycology , 1994 , 32 , 477 - 479 Aux membres du jury , A monsieur le Professeur Stéphane PICOT , ce travail a pu être réalisé , avec une grande liberté , au sein de votre laboratoire . Veuillez trouver ici l' expression de ma vive reconnaissance . A monsieur le Professeur Jean-Marie BASTIDE , vous avez accepté d' analyser et de juger ce travail . C' est un grand honneur pour moi . Je vous en remercie et tiens à vous assurer de mon profond respect . A monsieur le Professeur Dominique CHABASSE , pour avoir accepté de juger ce travail . Veuillez trouver ici le témoignage de ma reconnaissance et de ma profonde gratitude . A madame le Professeur Renée GRILLOT , pour m' avoir encouragé au cours de ce travail , et pour m' avoir soutenu et conseillé au sein du groupe EBGA . Soyez assuré de ma profonde gratitude . A madame le Docteur Florence PERSAT , pour avoir dirigé cette thèse . Ta disponibilité et tes conseils ont permis de mener ce travail à son terme dans d' excellentes conditions . Je tiens à remercier également Marie-Antoinette PIENS , qui m' a proposé ce sujet passionnant et qui m' a tout appris en mycologie médicale . Meja Rabodonirina , pour sa gentillesse et son aide précieuse , au cours de ce travail , mais aussi quotidiennement au laboratoire . Elisabeth Borel , qui a largement participé à ce travail avec patience et efficacité . Abdullahi Addo , pour son amitié et sa collaboration technique dans le domaine de l' anatomopathologie . Marie-France Monier , pour son aide technique et aussi pour sa patience et ses encouragements . Lucette Villard et Aline Farille pour leur gentillesse et leur efficacité . Karine Kaiser pour son amitié et son aide en biologie moléculaire . Tous les membres du laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale pour leur amitié et leur bonne humeur . Les membres du groupe EBGA , pour les réunions et les discussions stimulantes que nous avons partagées . Résumé Les infections aspergillaires invasives sont des maladies sévères dont la fréquence a récemment augmenté et pour lesquelles le traitement reste limité à deux antifongiques , l' itraconazole ( ITZ ) et l' amphotéricine B ( AMB ) . Le but de notre travail était de rechercher in vitro des résistances à ces antifongiques , de confirmer ces résistances in vivo chez l' animal , et d' aborder les mécanismes à l' origine de ces résistances . La réalisation de tests in vitro a permis de comparer la sensibilité relative des principales espèces d' Aspergillus spp. spp. à l' AMB et à l' ITZ et de détecter des souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ . Les techniques de détermination des concentrations minimales inhibitrices in vitro pour les champignons filamenteux étant encore mal standardisées , nous avons également tenté d' apporter des améliorations pour la réalisation de ces tests . Pour confirmer les résistances détectées in vitro , un premier modèle animal d' aspergillose pulmonaire invasive chez la souris immunodéprimée a été utilisé mais s' est avéré inadapté . En revanche , l' utilisation d' un autre modèle , réalisant une aspergillose disséminée chez la souris immunocompétente a permis de clairement confirmer la résistance à l' ITZ détectée in vitro de souches d' A. fumigatus . Si certaines souches d' A. fumigatus semblent naturellement résistantes à l' ITZ , nous avons pu montrer également que A. fumigatus pouvait acquérir une résistance à cet antifongique lors d' un traitement au long cours . Parmi les autres espèces d' Aspergillus , A . terreus est une espèce émergente responsable d' infections difficiles à traiter . Nous avons pu montrer chez l' animal , qu' une souche d' A. terreus était très résistante à l' AMB in vivo , mais que cette résistance était non détectable in vitro . Enfin , nous avons réalisé une étude biochimique de différentes souches d' A. fumigatus et montré que la résistance à l' ITZ n' était pas liée , pour les souches étudiées , à une modification qualitative ou quantitative des stérols membranaires . Summary The incidence of invasive Aspergillus infections has recently increased , and amphotericin B ( AMB ) and itraconazole ( ITZ ) are currently the only available drugs . The aim of our study was to detect the resistance to these two antifungals in vitro , to confirm the resistance in vivo using an animal model , and to examined the possible mechanism responsible for resistance . A comparison of the in vitro susceptibility of the major Aspergillus species against AMB and ITZ was performed and A. fumigatus isolates resistant to ITZ were detected . As methods for in vitro susceptibility testing of mold are currently not well standardized we tried to improve the technical procedures for these tests . In order to confirm the in vitro detected resistance we used an animal model of pulmonary invasive aspergillosis , but this model in immunocompromised mice was not useful . An other model of disseminated aspergillosis in non immunocompromised mice was then used and allowed to confirm the in vitro - detected resistance to ITZ of A. fumigatus isolates . If de novo to ITZ of A. fumigatus seems to occured , we also demonstrated that acquisition of resistance during prolonged ITZ therapy could appeared . Among other Aspergillus species , A . terreus is an emerging pathogen responsible for infections which are difficult to treat . We showed that an isolate of A. terreus was highly resistant to AMB in vivo . Nevertheless , the resistance was not detected in vitro . We have realised a biochemical study of different A. fumigatus isolates and showed that ITZ resistance was not related to qualitative or quantitative modifications of membrane sterols . Sommaire Abréviations Publications et communications relatives au travail de thèse Publications 1 . Dannaoui E. , Persat F. , Monier M.F. , Borel E. , Piens M.A. , Picot S . In-vitro susceptibility to amphotericin B and itraconazole of Aspergillus spp. isolates from patients . Journal of Antimicrobial Chemotherapy , 1999 , 44 , 553 - 555 . 2 . Dannaoui E. , Persat F. , Monier M.F. , Borel E. , Piens M.A. , Picot S . Use of spectrophotometric reading for in vitro antifungal susceptibility testing of Aspergillus spp. Canadian Journal of Microbiology , 1999 , in press . 3 . Tortorano A.M. , Dannaoui E. , Cogliati M. , Piens M.A. , Rigoni A.L. , Grillot R. , Viviani M.A. , EBGA Network . Evaluation of different in vitro procedures for testing amphotericin B and itraconazole susceptibility of Aspergillus fumigatus . Manuscrit en préparation 4 . Dannaoui E. , Addo A. , Borel E. , Piens M.A . , Persat F. , Picot S . Invasive aspergillosis associated with prolonged leukopenia in a murine model Journal de Mycologie Médicale , in press . 5 . Dannaoui E. , Borel E. , Persat F. , Monier M. F. , Piens M.A. , EBGA Network . In vivo itraconazole resistance of Aspergillus fumigatus in systemic murine aspergillosis Journal of Medical Microbiology , in press . 6 . Dannaoui E. , Persat F. , Borel E. , Piens M.A. , Picot S . Acquired resistance of Aspergillus fumigatus to itraconazole Manuscrit en préparation 7 . Dannaoui E. , Persat F. , Borel E. , Piens M.A. , Picot S . Amphotericin B resistance of Aspergillus terreus . Detection in a murine model of disseminated aspergillosis . Soumis à Journal of Medical Microbiology 8 . Dannaoui E. , Persat F. , Piens M.A. , Picot S . Sterol composition of itraconazole-resistant and -susceptible isolates of Aspergillus fumigatus . Manuscrit en préparation Communications dans des congrès Dannaoui E. , Monier M.F. , Persat F. , Borel E. , Picot S. , Piens M.A . Sensibilité aux antifongiques d' Aspergillus spp. spp. chez des patients infectés ou colonisés . Congrès de la société française de mycologie . 11 - 13 juin 1998 , Rennes . Dannaoui E. , Borel E. , Persat F. , Symoens F. , Picot S. , Piens M.A. , EBGA Network . Résistance d' Aspergillus spp. spp. aux antifongiques . Utilisation d' un modèle animal . Congrès de la société française de mycologie . 27 - 28 novembre 1998 . Paris . Dannaoui E. , Borel E. , Persat F. , Symoens F. , Picot S. , Piens M.A. , EBGA Network . Itraconazole resistance of Aspergillus spp. spp. in a murine model of disseminated aspergillosis . European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases . March 20 - 24 , 1999 , Berlin . Clin Microbiol Infect 1999 , 5 ( supl 3 ) , 284 . Dannaoui E . Sensibilité et résistance d' Aspergillus spp. spp. aux antifongiques . Etude in vitro et in vivo . XIIème réunion du groupe de recherche " Etude Aspergillose Sud-Est " 6 mai 1999 , Lyon . Introduction Introduction - Position du problème 1 . Aspergillus et aspergillose Les champignons du genre Aspergillus sont des moisissures ubiquitaires que l' on retrouve en abondance dans l' environnement . Parmi les nombreuses espèces décrites dans ce genre , seules quelques unes sont responsables d' infections chez l' homme . Si A. fumigatus est l' agent étiologique retrouvé dans la majorité des cas , d' autres espèces telles que A. flavus , A . niger , A . terreus , et A. nidulans peuvent être incriminées dans des processus pathologiques . Les Aspergillus sont des champignons opportunistes qui vont exprimer leur pouvoir pathogène chez des patients qui présentent une altération locale ou générale des systèmes de défense de l' organisme , ce qui provoque différentes formes d' aspergilloses , dont les plus graves sont les formes invasives . Ces infections invasives dues aux Aspergillus sont de plus en plus fréquentes du fait de l' augmentation des facteurs de risque pour cette pathologie , en particulier la neutropénie chez les patients d' onco-hématologie et les patients traités par des chimiothérapies anticancéreuses , la corticothérapie au long cours , les traitements immunosuppresseurs chez les transplantés d' organe et à un moindre degré chez les patients atteints de SIDA . La mortalité des patients atteints d' aspergillose invasive reste très élevée et l' arsenal thérapeutique est encore très limité . En effet , seules deux molécules sont actuellement utilisables : l' amphotéricine B ( AMB ) et l' itraconazole ( ITZ ) . L' AMB sous sa forme désoxycholate ( Fungizoneâ ) reste le traitement de référence de première intention , mais le taux de réponse reste faible , de l' ordre de 35 % . De plus l' utilisation de l' AMB est grevée d' une toxicité importante , en particulier rénale . Les autres formes récentes , associées à des lipides , semblent moins toxiques mais encore peu utilisées en raison de leur coût . L' ITZ présente une toxicité moins importante , mais n' est actuellement disponible que par voie orale . L' utilisation de ces deux antifongiques à titre prophylactique ou empirique doit faire redouter l' apparition de souches résistantes cliniquement , isolées à partir de prélèvements de patients , qui seront alors responsables d' infections encore plus difficiles à gérer sur le plan thérapeutique . La résistance clinique peut être définie comme l' inefficacité thérapeutique d' un traitement antifongique au cours d' une infection fongique . Différents facteurs liés à la souche responsable de l' infection peuvent être en cause dans cette résistance clinique . Il peut s' agir d' une résistance intrinsèque de la souche , du remplacement de la souche par une autre espèce moins sensible ( remplacement de C. albicans par C. glabrata ou C. krusei ) , ou du remplacement par une souche plus résistante mais appartenant à la même espèce . Enfin des altérations génétiques peuvent rendre une souche résistante de façon définitive ou transitoire . Une telle sélection de souches résistantes a déjà été observée dans le cas du fluconazole chez les patients sidéens porteurs de candidoses oropharyngées . Pour les souches d' Aspergillus les résistances in vitro aux antifongiques semblaient encore peu fréquentes il y a quelques années , mais une augmentation significative a été observée dernièrement . Les premières souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ in vivo ont été décrites sur modèle animal et caractérisées très récemment . 2 . Tests de sensibilité aux antifongiques La détection de ces souches résistantes pose encore beaucoup de problèmes . En effet , les techniques de détermination des sensibilités in vitro aux antifongiques manquent de reproductibilité et la corrélation entre résultats in vitro et efficacité thérapeutique in vivo est mauvaise , contrairement au cas des antibiotiques antibactériens . Plusieurs études multicentriques ont néanmoins permis de standardiser les conditions de réalisation de ces tests in vitro pour les levures . En revanche , pour les champignons filamenteux , les essais de standardisation en sont encore à leur début . C' est en 1982 que le « Subcommittee on Antifungal Susceptibility Tests » du « National Committe for Clinical Laboratory Standards » ( NCCLS ) a débuté des études multicentriques pour standardiser les différents paramètres intervenant dans les tests de sensibilité des champignons aux antifongiques . Ces travaux ont abouti en 1992 à la publication du document M-27P proposant une technique de macrodilution en milieu liquide . Cette proposition de technique a ensuite été approuvée et le document correspondant M-27A publié en 1995 décrit en détail la technique de macrodilution ainsi que l' adaptation possible en technique de microdilution . Cette standardisation concerne uniquement les tests de sensibilité pour les espèces du genre Candida et Cryptococcus neoformans neoformans . Les principales caractéristiques sont l' utilisation d' un milieu de culture synthétique ( RPMI- 1640 tamponné par du MOPS ) , la préparation des dilutions d' antifongiques selon un schéma particulier , un inoculum de 0 , 5 à 2 , 5 x 103 UFC / ml , une incubation de 48h ( Candida spp. ) ou 72h ( C. neoformans ) à 35 °C , et une lecture visuelle des concentrations minimales inhibitrices ( CMI ) . La CMI est définie par une inhibition complète de la pousse pour l' AMB et une inhibition marquée pour les azolés et la 5- fluorocytosine . Ces dernières années , différents travaux ont tenté de mettre en évidence des corrélations entre CMI déterminées avec la technique standardisée du NCCLS et évolution clinique chez l' homme , pour les infections à levures . Néanmoins , de nombreux facteurs interviennent dans l' évolution clinique d' une infection fongique , en dehors des facteurs intrinsèques au champignon . Parmi ces facteurs on trouve la pharmacocinétique de l' antifongique et les interactions avec les autres thérapeutiques , la maladie sous-jacente et en particulier le statut immunitaire de l' hôte , le site et la sévérité de l' infection , la virulence du micro-organisme en cause . Dans certaines situations ces facteurs sont plus déterminants pour l' évolution clinique du patient que les valeurs de CMI . De ce fait la constatation d' une CMI basse ne prédit pas toujours l' efficacité thérapeutique . A l' inverse une CMI haute est souvent un facteur prédictif d' échec du traitement . Pour les infections à champignons filamenteux , les travaux sont encore peu avancés . 3 . Modèles animaux d' aspergillose Pour résoudre ces problèmes , pour l' étude des infections dues aux Aspergillus spp. , l' utilisation de modèles animaux d' aspergillose permettant de s' affranchir de la variation des facteurs d' hôte et de se rapprocher des conditions retrouvées en clinique , est indispensable . Les relations in vitro - in vivo dans les modèles animaux ont donné des résultats probants pour les levures dans différentes situations : résistance de Candida albicans à l' AMB , au fluconazole , et à l' ITZ . Les modèles expérimentaux d' aspergillose chez l' animal sont utilisés de longue date , que ce soit chez la souris , le rat , le cobaye ou le lapin . Les deux principaux modèles utilisés sont l' infection disséminée obtenue par injection intraveineuse de spores chez l' animal immunocompétent et l' aspergillose pulmonaire invasive ( API ) obtenue par inoculation intranasale de spores chez l' animal immunodéprimé . Ces modèles ont permis en particulier l' étude de l' efficacité de molécules antifongiques classiques ou en cours de développement Par ailleurs , les modèles animaux d' aspergillose invasive sont suffisamment performants pour qu' une très nette différence en terme de mortalité et d' infection tissulaire puisse être mise en évidence entre animaux traités et témoins . Sur le plan pratique , les modèles murins sont bien adaptés pour l' utilisation d' un nombre suffisant d' animaux permettant ainsi une analyse statistique aisée des résultats . 4 . Mécanismes de la résistance aux antifongiques Les mécanismes de résistance des souches d' A . fumigatus sont encore , en grande partie , indéterminés . Bien que le mécanisme d' action de l' AMB sur les champignons ne soit pas complètement élucidé , la cible principale est l' ergostérol membranaire . L' AMB se lie à l' ergostérol membranaire , entraînant une augmentation de la perméabilité membranaire , suivie d' une fuite des constituants intracellulaires aboutissant à la mort cellulaire . Pour les levures , la plupart des souches résistantes à l' AMB ont des altérations qualitatives ou quantitatives de la composition lipidique membranaire . Pour l' ITZ , le mécanisme d' action passe par une inhibition de la stérol 14-a -déméthylase , enzyme intervenant dans la synthèse de l' ergostérol membranaire . La résistance des levures aux azolés n' est probablement pas univoque et plusieurs mécanismes peuvent intervenir . Une modification de la pénétration intracellulaire ou efflux actif de l' antifongique peut être en cause . L' altération de la concentration intracellulaire des azolés a été identifiée comme cause de la résistance chez C. albicans et C. glabrata . Cette altération est généralement liée à la présence de pompes membranaires entraînant un efflux actif de l' antifongique . La résistance liée à une modification de l' affinité de la 14-a -déméthylase peut être due à des mutations ponctuelles de l' enzyme dont l' affinité pour les dérivés azolés sera alors diminuée . Enfin une mutation de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase , autre enzyme de la voie de biosynthèse de l' ergostérol , peut être responsable de la résistance . En effet , la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase est une enzyme intervenant dans la synthèse de stérols toxiques pour le champignon lors du traitement par les azolés . Une inactivation de cette enzyme , par mutation , permet au champignon d' échapper à l' effet toxique des stérols anormaux et rend ainsi la souche résistante aux azolés . Pour A. fumigatus , à ce jour , les mécanismes de résistance à l' ITZ n' ont été explorés que pour trois souches . Pour deux d' entre elles , le mécanisme semble être une altération de la stérol 14-a -déméthylase , mais les études biochimiques sont encore en cours . 5 . Problématique et démarche Les données actuellement disponibles , peu nombreuses , laissent persister plusieurs questions : - Quelle est la fréquence des souches d' Aspergillus spp. spp. résistantes in vitro ? et comment détecter ces résistances au laboratoire ? - Les résistances détectées in vitro se traduisent -elles par des résistances in vivo ? - Quel est le mécanisme de la résistance ? Nous avons tenté de répondre à ces questions : Dans un premier temps , nous avons testé l' activité de l' AMB et de l' ITZ sur des souches d' Aspergillus spp. spp. d' origine clinique , par une technique de type NCCLS afin de détecter d' éventuelles résistances . Nous avons également tenté d' apporter des améliorations techniques pour la détermination des CMI . Dans un deuxième temps , des modèles murins d' API chez la souris immunodéprimée et d' aspergillose disséminée chez la souris immunocompétente , ont été testés avec des souches sensibles in vitro afin de déterminer quel était le modèle dans lequel la meilleure efficacité thérapeutique était obtenue . Les souches résistantes in vitro ont ensuite été testées in vivo chez l' animal dans le modèle le plus approprié . Une partie de ces travaux a été réalisée dans le cadre du groupe européen EBGA Network ( European research group Biotypes and Genotypes of Aspergillus fumigatus ) . Ce réseau qui regroupe 8 centres dans 6 pays européens , a pour mission de collecter et d' étudier des souches d' A. fumigatus d' origine géographique diverse , provenant de populations définies de patients . Font partie des objectifs du réseau l' étude de la sensibilité in vitro des souches d' origine clinique aux antifongiques actuels et à ceux en cours de développement . La participation de plusieurs laboratoires a permis dans un premier temps de tester différents paramètres pouvant être à l' origine du manque de reproductibilité inter-laboratoire des tests de sensibilité aux antifongiques . Par la suite l' étude in vitro d' un grand nombre de souches devrait permettre d' évaluer la fréquence d' apparition de la résistance aux antifongiques chez les patients en cours de traitement . Enfin l' étude des corrélations entre activité in vitro et efficacité in vivo chez l' animal , fait également partie des objectifs du groupe . Une première approche pour définir les mécanismes possibles de résistance consiste à analyser la composition en stérols membranaires de souches sensibles et de souches résistantes afin de déterminer si une modification des stérols pouvait expliquer les résistances détectées in vitro et confirmées in vivo . Résultats 1 . Sensibilité in vitro des Aspergillus spp. spp. Nous avons testé in vitro 230 souches d' Aspergillus spp. spp. isolées au laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale des Hospices Civils de Lyon ( Pr . S. Picot ) . Ces souches appartenaient aux 5 espèces les plus souvent rencontrées en pathologie humaine ( A. fumigatus , A . flavus , A . niger , A . terreus , et A. nidulans ) . L' objectif était de comparer la sensibilité respective des différentes espèces et de détecter d' éventuelles souches résistantes à l' ITZ et/ou à l' AMB . Sur le plan technique une méthode de microdilution en milieu liquide du type NCCLS a été utilisée . En effet , seule l' utilisation d' une technique ayant montré une bonne reproductibilité inter-laboratoire permet de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature . Les travaux récents de standardisation du NCCLS ont conduit à la publication d' une proposition de technique sous la forme du document M-38P destiné aux tests de sensibilité de certains champignons filamenteux ( Aspergillus spp. , Fusarium spp. , Rhizopus spp. , Pseudallescheria boydii , et la forme mycélienne de Sporothrix schenckii ) . Cette technique préconise l' utilisation du RPMI- 1640 avec L-glutamine , sans bicarbonate , tamponné avec du MOPS , comme milieu de culture dans le test . L' inoculum est constitué de conidies à une concentration finale dans le test de 0 , 4 à 5x104 UFC / ml . Cet inoculum est préparé par mesure de la turbidité au spectrophotomètre avec un ajustement de la densité optique ( DO ) qui est variable en fonction du champignon étudié . Le format de la technique est un test de microdilution en milieu liquide . L' incubation est de 48h à 35 °C et la lecture des CMI se fait à 100 % d' inhibition pour l' AMB et à environ 50 % d' inhibition pour les azolés . Nous avons utilisé ce type de technique avec quelques modifications . La préparation de l' inoculum a été réalisé par comptage à l' hématocytomètre et la suspension ajustée à 1x104 conidies / ml . La détermination des CMI pour l' ITZ a été faite à environ 75 % d' inhibition , ce qui était préconisé initialement dans les travaux du NCCLS . La modification du critère de lecture pour l' ITZ ne devrait pas avoir une influence importante sur les résultats des CMI dans la mesure où la pousse résiduelle , fréquente avec les levures du genre Candida , semble peu marquée avec les champignons filamenteux du genre Aspergillus . Article 1 . In-vitro susceptibility to amphotericin B and itraconazole of Aspergillus spp. spp. isolates from patients . Eric DANNAOUI , Florence PERSAT , Marie-France MONIER , Elisabeth BOREL , Marie-Antoinette PIENS and Stéphane PICOT Journal of Antimicrobial Chemotherapy , 1999 , 44 , 553 - 555 . 2 . Détermination des CMI par lecture spectrophotométrique L' étude des souches d' origine clinique a permis de détecter des résistances à l' ITZ pour quatre souches d' A. fumigatus et une souche d' A. nidulans . En revanche , les CMI de l' AMB était & 194;& 163; 2 µg / ml pour toutes les souches testées . La technique que nous avons utilisée présente certains inconvénients . Nous avons donc tenté d' apporter des améliorations à cette technique . La mise au point d' une technique reproductible de détermination des CMI des levures et des champignons filamenteux nécessite une détermination objective de la concentration minimale d' antifongique inhibant la pousse soit totalement ( pour l' AMB ) , soit partiellement ( pour l' ITZ ) . Actuellement , quel que soit le format de la technique utilisée , microméthode ou macrométhode , la lecture est réalisée visuellement . Cette lecture est donc dépendante du lecteur et représente un facteur de variabilité des résultats , en particulier pour les antifongiques azolés tel que l' ITZ . En effet , les antifongiques azolés donnent lieu à un phénomène de " traînée " : une pousse résiduelle est observée pour des concentrations supérieures à celle de la CMI . La CMI est alors la concentration pour laquelle on observe une inhibition de pousse de l' ordre de 50 à 75 % et non pas une inhibition complète comme pour l' AMB . L' estimation visuelle d' une inhibition partielle est délicate et induit des variations inter-individuelles de lecture . Des améliorations pour simplifier la détermination visuelle des CMI ont été mises au point en particulier l' utilisation d' un indicateur d' oxydoréduction ( Alamar Blue ) . Néanmoins , dans ce cas la lecture reste visuelle , longue à réaliser et subjective . Les puits dans lesquels le champignon a poussé sont roses alors que ceux dans lesquels il n' y a pas eu de pousse restent bleus . L' inhibition partielle de pousse se traduit alors par une couleur mauve . Pour ces raisons , il nous paraissait intéressant de tester une méthode plus objective de lecture comme une technique spectrophotométrique . Pour chaque concentration d' antifongique testée , la DO de chaque puits de la microplaque est comparée à celle du témoin de pousse ce qui permet de déterminer avec précision 75 % d' inhibition . De plus , cette méthode présente l' avantage de la rapidité de lecture et de la possibilité d' automatisation , et ceci grâce à du matériel qui est disponible dans la plupart des laboratoires . Enfin il est possible d' utiliser un programme informatique ( par exemple macroinstruction du logiciel Microsoft Excel ) pour calculer automatiquement la valeur de la CMI à partir des DO de chaque puits . Article 2 . Use of spectrophotometric reading for in vitro antifungal susceptibility testing of Aspergillus spp. Eric DANNAOUI , Florence PERSAT , Marie-France MONIER , Elisabeth BOREL , Marie-Antoinette PIENS , Stéphane PICOT . Canadian Journal of Microbiology , 1999 , in press . 3 . Détermination des CMI in vitro - étude multicentrique La détermination des CMI des champignons filamenteux peut être influencée par de nombreux paramètres techniques . Nous avons pu montrer que la lecture spectrophotométrique pouvait remplacer la lecture visuelle et présentait l' avantage d' une plus grande objectivité et d' une possibilité d' automatisation . Néanmoins , d' autres améliorations pouvaient être apportées . Dans le cadre du groupe EBGA , une étude multicentrique a été réalisée . Deux laboratoires , l' un en France et l' autre en Italie , ont participé à cette étude pour tester l' influence de différents paramètres sur la reproductibilité et sur la capacité de la technique à détecter la résistance in vitro de souches d' Aspergillus spp. spp. à l' AMB et à l' ITZ . Un ensemble comprenant cinq souches d' Aspergillus de référence ( quatre souche d' A. fumigatus IHEM 13936 , IHEM 13935 , IHEM 9417 et IHEM 1463 , et une souche d' A. alliaceus IHEM 4191 ) a été utilisé . Une souche de levure ( C. parapsilosis ATCC 22019 recommandée par le NCCLS ) a été incluse comme contrôle de qualité . Parmi les souches d' Aspergillus , deux étaient résistantes à l' ITZ ( IHEM 13936 , IHEM 13935 ) et une résistante à l' AMB ( IHEM 4191 ) . Plusieurs paramètres ont été étudiés . Deux types d' inoculum ont été testés : conidies et conidies plus hyphes , la différence provenant de la préparation . Dans le premier cas ( conidies seules ) la culture fongique est lavée , sans toucher la surface par du NaCl 0 , 9 % contenant 0 , 05 % de Tween 80 . Dans le deuxième cas ( conidies et hyphes ) , la culture fongique est recouverte par du NaCl 0 , 9 % sans détergent et la surface est légèrement grattée à l' aide d' une pipette . Dans les deux cas la suspension correspondante est ajustée entre 0 , 09 et 0 , 11 de DO à l' aide d' un spectrophotomètre . Un deuxième paramètre est le test du solvant . Les deux antifongiques testés , AMB et ITZ , sont des molécules non hydrosolubles qu' il faut dissoudre dans un solvant approprié . Si pour l' AMB ce solvant est habituellement le diméthylsulfoxide ( DMSO ) , pour l' ITZ différents types de solvants sont utilisés . Nous avons testé le DMSO et le mélange HCl - éthanol . Deux types de format de technique ont également été réalisés en parallèle : une technique en milieu liquide en microplaque et une technique en milieu solide gélosé . Ce dernier type permet de visualiser l' aspect macroscopique des colonies fongiques , ce qui n' est pas possible en milieu liquide . Pour chacun de ces deux formats de technique , deux milieux de culture ont été utilisés : RPMI- 1640 et Antibiotic medium 3 ( AM3 ) . Pour chacun des milieux , une supplémentation en glucose a été faite , ce qui favorise la pousse des champignons . Il est à noter que le RPMI est un milieu synthétique de composition parfaitement définie , alors que le milieu AM3 est un milieu complexe avec possibilité de variation d' un lot à l' autre . Enfin la lecture a été réalisée après 48h et 72h d' incubation , soit visuellement à l' aide d' un miroir de lecture , soit par méthode spectrophotométrique . Pour chaque combinaison la reproductibilité intra-laboratoire et inter-laboratoire a été déterminée . Article 3 . Evaluation of different in vitro procedures for testing amphotericin B and itraconazole susceptibility of Aspergillus fumigatus . Anna-Maria Tortorano , Eric Dannaoui , M. Cogliati , Marie-Antoinette Piens , A.L . Rigoni , Renée Grillot , Maria-Anna Viviani , EBGA Network Manuscrit en préparation 4 . Mise au point d' un modèle animal d' aspergillose pulmonaire invasive Les différents travaux concernant la détermination des CMI in vitro nous ont permis d' apporter des améliorations techniques et d' identifier certaines souches d' Aspergillus résistantes à l' ITZ . Néanmoins , l' absence de standardisation des tests de détermination des CMI in vitro , et surtout le manque de données concernant la corrélation in vitro - in vivo pour les champignons filamenteux , nécessite de confirmer in vivo les résistances détectées in vitro . Chez l' homme les facteurs de risque et les traitements associés sont variables et rendent l' analyse des corrélations in vitro - in vivo difficile . L' utilisation d' un modèle animal permet , en travaillant dans des conditions contrôlées , de supprimer la variation de ces paramètres . De nombreux modèles animaux d' aspergillose invasive ont été utilisés . Nous avons choisi de développer un modèle d' API chez la souris leucopénique de façon persistante afin de se rapprocher le plus possible de la pathologie humaine , telle qu' on peut la rencontrer au cours des épisodes d' aplasie médullaire chez les patients d' hématologie . Dans un premier temps , différents protocoles d' immunodépression ont été testés , avec un produit neutropéniant , afin de déterminer celui qui permettait d' obtenir une leucopénie persistante . Nous avons utilisé le cyclophosphamide ( CY ) , en répétant ou non les injections afin de voir s' il était possible de maintenir un taux de leucocytes bas tout au long de l' expérimentation . Différentes doses d' inoculum ont ensuite été testées , l' objectif étant d' obtenir une mortalité importante ( de l' ordre de 90 % ) dans un délai de 7 à 15 jours après l' infestation . En effet l' objectif final était de mettre au point un modèle permettant de mettre en évidence des différences d' activité thérapeutique entre souches sensibles et souches résistantes . Pour cela il était nécessaire d' obtenir une mortalité importante chez les animaux contrôles non traités et une bonne activité thérapeutique chez les animaux traités , infectés par des souches sensibles . Pour espérer obtenir la meilleure activité thérapeutique il fallait que l' infection progresse le plus lentement possible pour que le traitement ait le temps d' agir . Une infection entraînant la mort très rapidement risque en effet d' échapper à toute thérapeutique . Dans ce modèle expérimental , les animaux étant immunodéprimés , il était nécessaire de les protéger de possibles infections opportunistes . Pour cela , la nourriture était stérile , l' eau de boisson stérile était supplémentée en antibiotiques , et les cages munies de couvercles filtrants . L' évaluation de l' infection a été faite sur la mortalité et la culture des poumons ( organe cible ) . Des cultures d' autres organes ( rein et cerveau ) ont également été pratiquées afin d' évaluer une possible dissémination de l' infection par voie hématogène . Les rétrocultures d' organes ont été complétées par une étude anatomo-pathologique afin de s' assurer du caractère invasif de l' infection obtenue . Article 4 . Invasive aspergillosis associated with prolonged leukopenia in a murine model . Eric DANNAOUI , Abdullahi ADDO , Elisabeth BOREL , Marie-Antoinette PIENS , Florence PERSAT , Stéphane PICOT Journal de Mycologie Médicale , in press . 5 . Utilisation du modèle d' aspergillose pulmonaire invasive Le modèle d' API chez la souris leucopénique étant au point , l' étape suivante était le test du traitement par AMB , qui est la thérapeutique de référence , puis , si ce dernier était efficace , de l' ITZ ( voir matériel et méthodes en annexe 1 ) . L' objectif était d' obtenir un taux de mortalité élevé chez les animaux non traités et un taux de survie le plus important possible chez les animaux traités . En effet , le modèle devait permettre de mettre en évidence une différence significative entre des souches sensibles et des souches résistantes aux antifongiques , ce qui impliquait d' avoir une très bonne efficacité thérapeutique avec les souches sensibles . Différentes doses d' AMB ont donc été testées à partir de 2 mg / kg / j , en s' assurant de l' absence de toxicité liée au traitement . Plusieurs expérimentations préliminaires ont ainsi été conduites chez des animaux non infectés qui ont reçu un traitement par AMB par voie intrapéritonéale . Une toxicité , en terme de mortalité , n' est apparue que pour des posologies très élevées de 15 mg / kg / j . Des dosages d' AMB dans le sérum et dans les tissus ( rein et poumon ) ont été réalisés . Ces dosages montraient que les animaux présentaient des taux sanguins et tissulaires efficaces et que ces taux étaient proportionnels à la dose administrée . Par exemple pour une posologie de 10 mg / kg / j , le taux sérique obtenu était de 0 , 7 µg / ml et les taux tissulaires dans le poumon et les reins de 19 , 8 et 48 , 1 µg / g , respectivement . Plusieurs expérimentations ont ensuite été menées pour évaluer l' efficacité thérapeutique de l' AMB chez les animaux infectés . A une posologie de 4 mg / kg / j pendant 10j aucune efficacité thérapeutique en terme de mortalité n' apparaissait par rapport aux animaux témoins non traités ( 70 et 90 % de mortalité pour le groupe traité et le groupe contrôle , respectivement ) . Des posologies plus importantes de 10 mg / kg / j et 15 mg / kg / j , atteignant ainsi la limite de la toxicité , n' ont pas permis d' améliorer la survie des animaux de façon significative . Pour améliorer l' efficacité thérapeutique , certains paramètres du modèle ont été modifiés . L' immunodépression , qui est nécessaire pour obtenir l' infection par voie respiratoire , est également un facteur majeur limitant la réponse thérapeutique . Pour cette raison la durée de l' immunodépression a été diminuée , en limitant à deux le nombre d' injections de CY ( au lieu de cinq injections ) . Après avoir déterminé la DL 90 % dans le cadre de ce nouveau schéma d' immunodépression , différentes posologies d' AMB ont été testées . Une efficacité thérapeutique partielle a pu ainsi être obtenue avec une réponse dose-dépendante , la mortalité passant de 100 % pour les contrôles à 70 % , 55 % et 40 % pour des doses de 3 mg / kg / j , 5 mg / kg / j et 7 , 5 mg / kg / j respectivement . Néanmoins , ceci était insuffisant pour espérer obtenir une différence significative entre souches sensibles et résistantes . Des essais ont également été réalisés en utilisant un corticoïde comme produit immunodépresseur à la place d' un neutropéniant , la corticothérapie étant un facteur de risque important pour l' API . Néanmoins , dans ce modèle une mortalité d' environ 30 % est apparue chez les animaux non infectés correspondant à une toxicité de l' association corticoïde - AMB , ce qui excluait ce modèle pour notre étude . Les différentes expérimentations réalisées pour la mise au point de ce modèle d' API n' ont pas donné lieu à une publication . 6 . Mise au point d' un modèle d' aspergillose disséminée Il n' a donc pas été possible d' obtenir un modèle d' API chez l' animal immunodéprimé dans lequel le traitement par AMB était suffisamment efficace . Ce type de modèle paraissait donc peu adapté à la mise en évidence d' une différence de mortalité entre des groupes d' animaux infectés par une souche d' Aspergillus sensible et des groupes infectés par une souche résistante . Dans ces conditions il était indispensable de changer de modèle animal . Nous avons donc utilisé un modèle d' aspergillose disséminée chez la souris non immunodéprimée , largement utilisé dans d' autres études . Dans ce modèle l' infection est réalisée par injection intraveineuse d' une suspension de spores , l' infection aspergillaire ayant alors pour principales cibles les organes profonds ( en particulier le rein et le cerveau ) et à un moindre degré le poumon . Ce type d' infection est donc plus éloigné de la pathologie humaine que le modèle respiratoire d' API , mais la mortalité des animaux survenant moins rapidement après l' infestation , une meilleure efficacité thérapeutique était attendue . Afin d' être dans les conditions optimales pour distinguer souches sensibles et souches résistantes dans ce modèle d' aspergillose disséminée , l' objectif était toujours d' avoir , pour une souche sensible , environ 90 % de mortalité chez les animaux infectés non traités et 0 % de mortalité chez les animaux infectés traités par AMB ou ITZ . Il était également nécessaire de déterminer pour chaque souche étudiée la dose létale 90 % ( dose de spores pour laquelle on obtient une mortalité de 90 % ) car la virulence peut être variable d' une souche à l' autre . Des expérimentations préliminaires ont été conduites afin de déterminer les posologies d' AMB et d' ITZ minimales permettant d' obtenir 100 % de survie des animaux infestés . Des souches d' A. fumigatus de référence , connues pour être résistantes à l' ITZ in vitro et in vivo chez l' animal , ont été utilisées comme témoins pour s' assurer que le modèle était capable de distinguer les souches sensibles et les souches résistantes . Deux souches d' A. fumigatus détectées lors du " screening " in vitro ( cf. article 1 ) , l' une sensible et l' autre résistante à l' ITZ ont ensuite été testées dans ce modèle afin de confirmer in vivo la résistance détectée in vitro . L' efficacité thérapeutique a été évaluée non seulement sur le taux et le délai de mortalité des animaux , mais aussi sur la capacité du traitement à diminuer totalement ou partiellement l' infection tissulaire . Pour cela , les principaux organes cibles , rein et cerveau , ont été systématiquement prélevés et mis en culture pour déterminer les UFC indiquant le taux d' infection tissulaire . Article 5 . In vivo itraconazole resistance of Aspergillus fumigatus in systemic murine aspergillosis Eric DANNAOUI , Elisabeth BOREL , Florence PERSAT , Marie-France MONIER , Marie-Antoinette PIENS , EBGA Network . Journal of Medical Microbiology , 1999 , in press . 7 . Résistance acquise à l' itraconazole L' étude précédente a montré qu' il était possible de confirmer in vivo les résistances à l' ITZ détectées in vitro . Il est particulièrement intéressant de noter que la souche résistante à l' ITZ isolée au laboratoire provenait d' un patient traité par AMB pour une infection aspergillaire invasive . Aucun traitement par ITZ n' a été administré chez ce patient . Ceci suggère que certaines souches d' A. fumigatus responsables d' infection chez l' homme peuvent être résistantes de novo à l' ITZ . Ceci souligne l' intérêt de la détermination de la CMI de l' ITZ lors de l' isolement d' une souche d' Aspergillus chez un patient porteur d' une infection aspergillaire . Néanmoins , chez certaines levures du genre Candida , il a été observé une apparition de résistance aux azolés durant le traitement au long cours par ces antifongiques . Nous avons donc recherché une telle induction de résistance pour A . fumigatus . Pour cela , nous avons sélectionné des patients porteurs d' infection aspergillaire et traités au long cours par ITZ , et nous avons retenu ceux pour lesquels des isolements itératifs d' A. fumigatus avaient été obtenus . Il s' agissait pour la plupart , de patients greffés pulmonaires colonisés au long cours , ou de patients porteurs d' infections semi-invasives dont le facteur de risque était une corticothérapie . Les différentes souches ont été testées in vitro pour détecter une éventuelle apparition de résistance à l' ITZ . Il a été ainsi identifié un patient porteur initialement d' un aspergillome qui a évolué vers une aspergillose nécrosante chronique et pour lequel plusieurs isolats d' A. fumigatus ont été obtenus de prélèvements respiratoires sur une période d' environ six mois . Deux isolats obtenus en début de traitement par ITZ étaient sensibles in vitro à l' ITZ , tandis que deux autres isolats obtenus après plus de quatre mois de traitement par ITZ étaient résistants in vitro à l' ITZ . Pour chacun des isolats , une expérimentation préliminaire a été menée en testant trois doses croissantes d' inoculum ( chacune des doses était testée sur un groupe de 10 souris ) afin de déterminer la dose létale 90 % . Cette étape a permis de s' affranchir des variations éventuelles de virulence des différents isolats . Ensuite , une expérimentation animale avec un traitement par ITZ et AMB a été réalisée pour chaque isolat en utilisant le modèle d' aspergillose disséminée chez la souris non immunodéprimée . Les quatre isolats présentaient des caractéristiques macroscopiques particulières ( faible sporulation ) , ce qui suggérait l' hypothèse d' une seule souche et non pas d' une infection secondaire du patient par une souche résistante provenant de l' environnement . Néanmoins , il fallait vérifier que ces isolats étaient de même génotype . Pour cela un typage moléculaire des quatre isolats a été réalisé en RAPD en utilisant différentes amorces discriminantes pour A. fumigatus . Article 6 . Acquired resistance of Aspergillus fumigatus to itraconazole . Eric DANNAOUI , Florence PERSAT , Elisabeth BOREL , Marie-Antoinette PIENS , Stéphane PICOT Manuscrit en préparation 8 . Résistance d' Aspergillus terreus à l' amphotéricine B Les travaux précédants ont montrés que la résistance de souches d' A. fumigatus , détectées in vitro , a pu être confirmée in vivo chez l' animal . Pour certaines souches la résistance apparaissait de novo alors que pour d' autres l' apparition de la résistance à l' ITZ survenait lors d' un traitement au long cours par cet antifongique . Si le principal agent étiologique des infections invasives aspergillaires est A. fumigatus , d' autres espèces d' Aspergillus peuvent être impliquées , en particulier A. flavus , A . terreus , A . nidulans et A. niger . Il semble que le pronostic des infections à A. terreus soit particulièrement sévère et les tests de sensibilité in vitro ont montré que cette espèce est moins sensible à l' AMB que A. fumigatus . En revanche , A . terreus conserve , in vitro , une bonne sensibilité à l' ITZ . Néanmoins , il n' existe pas actuellement de données concernant la sensibilité in vivo , dans un modèle animal , de A. terreus vis à vis des antifongiques disponibles , AMB et ITZ . La mise en évidence d' une résistance à l' un des antifongiques , in vivo , pourrait avoir des conséquences rapides en matière de démarche diagnostique ( nécessité d' un diagnostic d' espèce précis en cas d' isolement d' une souche d' Aspergillus ) et de choix thérapeutiques ( association d' antifongiques en cas de résistance ) . Pour ces raisons , nous avons testé in vivo chez l' animal , dans des conditions contrôlées , une souche d' A. terreus . Cette souche a été isolée chez un patient porteur d' une API et pour lequel toutes les données cliniques étaient disponibles . Cette souche a été testée dans le même modèle d' aspergillose disséminée chez la souris non immunodéprimée qui avait été utilisé pour tester les souches d' A. fumigatus . Après avoir déterminé la dose létale 90 % de la souche , un traitement par AMB a été réalisé et l' efficacité thérapeutique évaluée sur la mortalité et le degré d' infection tissulaire . Des souris infectées ont également été traitées par ITZ pour détecter une éventuelle résistance croisée pour cet antifongique . Une caractérisation biochimique des stérols membranaires a également été conduite afin de rechercher le mécanisme de résistance impliqué . En effet , la résistance des champignons à l' AMB est souvent liée à une modification des stérols membranaires , en particulier à une diminution de l' ergostérol . Une détermination qualitative et quantitative des différents stérols membranaires a donc été faite par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse . Article 7 . Amphotericin B resistance of Aspergillus terreus . Detection in a murine model of disseminated aspergillosis . Eric DANNAOUI , Florence PERSAT , Elisabeth BOREL , Marie-Antoinette PIENS , and Stéphane PICOT Soumis à Journal of Medical Microbiology 9 . Etude biochimique des stérols membranaires d' Aspergillus fumigatus Après avoir détecté in vitro des souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ et après avoir confirmé ces résistances in vivo dans un modèle animal , il se posait naturellement la question de l' origine moléculaire de cette résistance . La cible des antifongiques azolés est la 14 & 239;& 129;& 161;-déméthylase , enzyme intervenant au cours de la synthèse de l' ergostérol . L' inhibition de cette enzyme par les azolés conduit à l' accumulation de précurseurs entraînant la mort cellulaire . Les données actuelles concernant la résistance des champignons aux antifongiques azolés font état de différents mécanismes possibles . Il a été ainsi décrit des résistances liées à une modification de la cible de l' antifongique , à une surproduction de la cible , à un efflux actif de l' antifongique , ou à une mutation de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase . Dans ce dernier cas il existe une synthèse de stérols , absents chez les souches sensibles , qui peuvent remplacer les fonctions de l' ergostérol , permettant ainsi la survie de la cellule . Pour tester l' hypothèse d' une altération de la voie de synthèse de l' ergostérol comme substratum de la résistance à l' ITZ chez certaines souches , une étude qualitative et quantitative des stérols membranaires a été réalisée chez différentes souches sensibles et résistantes à l' ITZ . La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a été utilisée car cette technique permet à la fois une détection de très faibles quantités de stérols et une détermination fine de la structure de ces molécules . Article 8 . Sterol composition of itraconazole-resistant and -susceptible isolates of Aspergillus fumigatus . Eric DANNAOUI , Florence PERSAT , Marie-Antoinette PIENS , and Stéphane PICOT Manuscrit en préparation Synthèse 1 . Sensibilité in vitro des Aspergillus spp. spp. Dans ce travail , nous avons utilisé une technique de microdilution liquide dérivée de la technique du NCCLS pour les levures pour la détermination des CMI de nombreuses souches d' Aspergillus appartenant aux 5 espèces importantes en pathologie humaine . En effet , il n' existe pas actuellement de technique standardisée de détermination des CMI pour les champignons filamenteux . De nombreuses techniques ont été utilisées , souvent avec des résultats très différents . Néanmoins , des études multicentriques ont récemment montré que l' utilisation d' une technique de microdilution en milieu liquide utilisant le RPMI permettait d' obtenir une bonne reproductibilité inter-laboratoire . De plus l' utilisation de ce type de technique a permis la détection de la résistance d' A. fumigatus à l' ITZ . Dans notre série , A . flavus , A . nidulans et A. terreus ont des CMI pour l' AMB plus hautes que A. fumigatus et A. niger . Des résultats similaires ont été retrouvés par d' autres auteurs utilisant le même type de technique . Aucune souche ne présente une CMI pour l' AMB > 2 µg / ml . Néanmoins , il est bien démontré que l' utilisation du RPMI ne permet pas de détecter les résistances des levures à l' AMB . L' utilisation du milieu AM3 a permis d' améliorer la détection des résistances des levures à l' AMB . Néanmoins , l' intérêt du milieu AM3 pour la détection de la résistance des Aspergillus à l' AMB n' est pas encore établi . Récemment , une souche d' Aspergillus fumigatus a été retrouvée résistante à l' AMB dans un modèle d' aspergillose disséminée chez la souris mais aucun test n' a permis de détecter cette résistance in vitro . De ce fait , la fréquence des résistances à l' AMB pour Aspergillus reste largement inconnue , et il est nécessaire de mettre au point une technique permettant de détecter ces résistances in vitro . Dans notre série , quatre souches d' A. fumigatus ont été retrouvées résistantes in vitro à l' ITZ , sur 156 souches testées . Une souche a été isolée chez un patient qui n' a pas reçu de traitement par ITZ , ce qui suggère la possibilité d' une résistance de novo à l' ITZ . En revanche , la deuxième souche résistante à l' ITZ a été isolée chez un patient traité plusieurs mois par ITZ . De même les deux autres isolats résistants ont été obtenus chez un patient après plusieurs mois de traitement par ITZ , alors que les isolats initiaux , en début de traitement , étaient sensibles . Dans ce dernier cas il peut s' agir soit de l' acquisition de la résistance au cours du traitement , soit d' une contamination secondaire par une souche résistante . Une étude moléculaire de ces souches a été nécessaire pour trancher entre les deux hypothèses . Plusieurs études ont montré que l' ITZ avait une très bonne activité in vitro contre Aspergillus , et certaines de ces études , dans lesquelles 24 à 130 souches ont été testées , n' ont pas retrouvé de souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ . Néanmoins , d' autres études ont retrouvé des souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ . Denning et al. ont étudié deux souches d' A . fumigatus résistantes in vitro à l' ITZ et ont pu confirmer cette résistance in vivo dans un modèle d' aspergillose disséminée chez la souris . De même , dans autre étude il a été retrouvé , par la macrométhode du NCCLS , quatre souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ parmi 122 souches étudiées . L' ensemble de ces résultats démontre que certaines souches d' A. fumigatus sont résistantes à l' ITZ . Des études sur un plus grand nombre de souches sont nécessaires pour déterminer la fréquence de ce phénomène , qui semble être , à l' heure actuelle , de 2 à 6 % . Parmi les 79 souches d' Aspergillus non- fumigatus que nous avons étudiées , une souche d' A. nidulans présentait une CMI > 16 µg / ml pour l' ITZ . Cette souche avait été isolée chez un patient n' ayant pas reçu de traitement par ITZ . Ceci suggère qu' une résistance primaire à l' ITZ peut survenir pour des Aspergillus non-fumigatus . Pour les Aspergillus non-fumigatus , la fréquence de la résistance à l' ITZ ne pourra être évaluée précisément que par l' étude d' un plus grand nombre de souches . Les résultats de ce travail , ainsi que ceux d' autres études suggèrent que certaines souches d' Aspergillus spp. spp. peuvent être résistantes à l' ITZ . Néanmoins , le manque de données actuellement disponibles concernant la signification clinique des CMI implique que les résultats in vitro doivent être validés in vivo . 2 . Améliorations techniques de la détermination des CMI Les nombreux travaux du NCCLS ont permis de standardiser de nombreux paramètres intervenant dans la détermination des CMI . La lecture de la CMI est un paramètre majeur pouvant être responsable d' importantes variations dans les résultats . En effet , pour l' AMB la CMI est définie comme la plus petite concentration entraînant une inhibition complète de la pousse du champignon , ce qui est relativement facile à déterminer même en lecture visuelle . En revanche , l' inhibition partielle des azolés nécessite de définir la CMI comme la plus petite concentration entraînant une inhibition significative de la pousse ( entre 80 et 50 % d' inhibition , suivant le format de la technique ) . L' évaluation visuelle de cette inhibition partielle est subjective et donc dépendante du lecteur . Ceci est un facteur important de variation de la détermination des CMI et diminue la reproductibilité des techniques . La détermination des CMI , quel que soit le format de la technique utilisée , nécessite donc actuellement une lecture visuelle qui est subjective et longue à réaliser . C' est pour ces raisons que nous avons évalué une méthode spectrophotométrique pour la lecture des CMI en comparant les résultats avec la lecture visuelle . A notre connaissance , il s' agit de la première étude effectuant ce type de comparaison sur un grand nombre de souches d' Aspergillus spp. spp. Nous avons observé une bonne corrélation entre les deux méthodes pour l' AMB , mais aussi pour l' ITZ . Ceci est probablement lié à la pousse homogène des Aspergillus que l' on a obtenue dans les conditions techniques utilisées , mais aussi à la fréquence relativement faible du phénomène de " traînée " . Lorsque des différences étaient notées entre les deux techniques , les CMI étaient généralement plus faibles par spectrophotométrie , en particulier pour l' ITZ . Ceci reflète probablement la difficulté de déterminer visuellement 75 % d' inhibition . Il a été montré une corrélation entre détermination spectrophotométrique des CMI et lecture visuelle pour Candida albicans , pour d' autres espèces de Candida , et pour Cryptococcus neoformans neoformans . Néanmoins , pour les Aspergillus il existe très peu de données concernant des méthodes alternatives de détermination des CMI . Seules des techniques colorimétriques ont été testées . Dans une étude , l' utilisation d' un indicateur d' oxydoréduction ( Alamar blue ) a permis d' obtenir une bonne corrélation avec la lecture visuelle . Pourtant elle nécessite de différencier les couleurs bleues , roses et mauves , ce qui peut s' avérer difficile . Une autre technique utilisant un indicateur coloré a été proposée mais cette technique n' a pas été comparée à la technique recommandée par le NCCLS . L' un des problèmes limitant l' utilisation d' une détermination spectrophotométrique des CMI des champignons filamenteux est la pousse hétérogène qui a parfois été notée dans les puits des microplaques . Dans notre expérience , la pousse était homogène , ce qui est peut-être lié à l' absence de supplémentation en glucose du milieu de culture . La lecture spectrophotométrique permet donc une détermination objective des CMI , ce qui pourrait faciliter la comparaison des résultats entre laboratoires . De plus , cette méthode est bien adaptée à de grandes séries et offre la possibilité d' une automatisation de la lecture des DO de chaque puits des microplaques . Elle permet aussi un traitement informatique des données avec calcul direct des CMI . Dans le cadre du groupe EBGA , nous avons également testé l' influence de différents paramètres techniques sur la reproductibilité intra et inter-laboratoire de la détermination des CMI et sur la capacité de la technique à détecter les résistances . La concordance des résultats était similaire pour les milieux RPMI et AM3 , quel que soit le format utilisé ( microdilution liquide ou milieu gélosé ) . De même , le solvant utilisé pour l' ITZ ( DMSO ou HCl-éthanol ) n' influençait pas les résultats . Enfin , le type d' inoculum ( conidies seules ou conidies plus hyphes ) ne modifiait pas la reproductibilité que ce soit après 48h ou 72h d' incubation . Il est à noter que sur le plan pratique , la technique de microdilution liquide est moins lourde à utiliser et qu' un inoculum constitué de conidies seules est plus simple à préparer . Pour ces raisons , ce sont ces derniers paramètres qui ont été retenus pour la détermination des CMI de l' AMB et de l' ITZ des souches d' A . fumigatus étudiées au sein du groupe EBGA . 3 . Sensibilité in vivo - modèle d' aspergillose pulmonaire invasive Les modèles animaux d' API sont utilisés de longue date pour des études physiopathologiques et plus récemment pour tester de nouvelles molécules antifongiques . L' intérêt majeur de ces modèles est d' être proche de l' histoire naturelle de la maladie chez l' homme . Dans ces modèles , l' immunodépression peut être obtenue soit par des corticoïdes , soit par des produits neutropéniants . La neutropénie persistante étant le facteur de risque majeur d' API chez les patients porteurs de leucémie aiguë , nous avons privilégié ce type d' immunodépression en utilisant comme agent neutropéniant le CY . Nous avons pu monter qu' une seule injection de CY induisait une baisse significative du taux de leucocytes , ce qui est en accord avec les données de la littérature . Néanmoins , avec une ou même deux injections de CY , ce qui est généralement le schéma utilisé dans les modèles de la littérature , le taux de leucocytes se normalise rapidement . Ce n' est qu' en répétant les injections de façon régulière , tous les quatre jours , que l' on peut maintenir la neutropénie tout au long de l' expérimentation . Ce schéma d' immunodépression n' entraîne aucune mortalité chez les animaux non infectés . Dans ce modèle , il est possible d' induire une API prouvée par l' étude histopathologique , qui ne dissémine que dans environ 15 % des cas , ce qui ressemble à la maladie humaine . De plus , dans notre modèle , la mortalité des animaux est directement dépendante de la concentration de l' inoculum utilisé , ce qui permet de contrôler cette mortalité . Ce modèle d' API étant au point , nous l' avons utilisé pour tester l' efficacité des antifongiques , en premier lieu l' AMB , antifongique de référence . Dans un premier temps , différentes doses d' AMB ont été testées , chez des animaux non infectés , pour s' assurer de l' absence de toxicité du traitement . Par la suite , différentes doses d' AMB ont été utilisées chez les animaux infectés , mais l' efficacité thérapeutique est restée très limitée . La difficulté d' obtenir une bonne efficacité thérapeutique dans ce type de modèle avait déjà été notée dans des travaux précédents . C' est pour cette raison que le modèle a été modifié , en diminuant la neutropénie , qui restait néanmoins suffisante pour obtenir une infection invasive . Malgré la diminution de la durée de la neutropénie , en limitant le nombre d' injection de CY à deux , la mortalité des animaux traités restait trop élevée . L' utilisation des corticoïdes comme immunodépresseur , à la place du CY , n' a pas permis d' améliorer le modèle du fait de l' apparition d' une toxicité de l' association AMB - corticoïdes , comme cela avait déjà été décrit . Dans ces différents modèles , la faible efficacité thérapeutique peut être expliquée en partie par la mortalité très rapide des animaux après l' infestation . 4 . Sensibilité in vivo - modèle d' aspergillose disséminée Bien que le modèle d' API que nous avons mis au point soit potentiellement intéressant , l' efficacité limitée de l' AMB ne le rendait pas utilisable pour tester in vivo la résistance des souches aux antifongiques . De ce fait , nous sommes passés à un modèle différent , plus éloigné de la maladie humaine mais pour lequel le traitement devait être plus efficace . L' utilisation de ce modèle d' aspergillose disséminée chez la souris non immunodéprimée a permis d' obtenir une très bonne efficacité thérapeutique pour l' AMB et pour l' ITZ . C' est grâce à ce modèle que nous avons pu confirmer in vivo les résistances à l' ITZ détectées in vitro . Pour les différentes souches testées les groupes d' animaux contrôles présentaient une mortalité de 70 à 100 % , indiquant que le modèle est reproductible . Pour la souche IHEM 9900 , sensible in vitro à l' ITZ , le traitement prolongeait la survie et réduisait l' infection tissulaire dans le rein et le cerveau . En revanche , pour la souche AF 1422 , qui présentait une CMI élevée à l' ITZ ( > 16 µg / ml ) , le traitement par ITZ n' améliorait pas la survie ni ne réduisait l' infection des tissus , alors que l' AMB restait efficace . Ces résultats montrent qu' une résistance in vitro à l' ITZ est associée , dans ce modèle expérimental , à un échec thérapeutique in vivo . A notre connaissance , la confirmation in vivo chez l' animal , de la résistance d' A. fumigatus à l' ITZ n' a été réalisée que pour trois souches provenant de deux patients . Deux de ces souches précédemment décrites ( IHEM 13935 et IHEM 13936 ) ont été testées dans notre modèle comme souches de référence . In vitro , ces deux souches présentaient une CMI élevée pour l' ITZ ( > 16 µg / ml ) , ce qui était en accord avec les données publiées . Néanmoins , seule l' une d' entre elles ( IHEM 13936 ) a été retrouvée résistante in vivo dans notre modèle . En effet , pour la souche IHEM 13935 l' ITZ avait une bonne activité , aussi bien sur la mortalité des animaux que sur le degré d' infection tissulaire . Cette discordance entre nos résultats et ceux de la littérature , pour cette souche , provient probablement de la différence des modèles animaux utilisés . D' une part , cette souche n' était que partiellement résistante in vivo à l' ITZ avec une réponse thérapeutique dépendante de la posologie d' ITZ utilisée . Une bonne réponse était obtenue pour une dose d' ITZ de 150 mg / kg / j et une mauvaise réponse pour 50 mg / kg / j . Dans notre modèle , la souche apparaissait sensible in vivo pour une posologie d' ITZ intermédiaire de 100 mg / kg / j . D' autre part , dans notre modèle le traitement était débuté précocement , deux heures après l' infestation ( au lieu de 18h ) , ce qui pourrait expliquer la meilleure efficacité thérapeutique observée . Grâce à notre modèle nous avons pu confirmer chez l' animal la résistance à l' ITZ , détectée in vitro , d' une souche d' A . fumigatus ( AF 1422 ) . Cette souche a été isolée chez un patient qui avait été traité uniquement par AMB , ce qui indique une résistance de novo à l' ITZ . Il est intéressant de noter qu' il n' y avait pas de résistance croisée à l' AMB . Ces résultats soulignent l' intérêt de la détermination des CMI pour les champignons du genre Aspergillus . Néanmoins de nombreuses souches devront être testées in vitro et in vivo pour définir les seuils correspondant à la résistance . 5 . Résistance acquise à l' itraconazole Après avoir mis en évidence une résistance de novo à l' ITZ en dehors de tout traitement par ITZ , nous avons recherché si la résistance pouvait apparaître en cours de traitement . Une étude in vitro de souches isolées au cours du temps chez des patients colonisés et traités par ITZ a déjà suggéré une telle hypothèse . Néanmoins , dans cette étude , il n' a pas été réalisé d' étude moléculaire permettant de trancher entre l' hypothèse d' un remplacement d' une souche sensible par une autre souche résistante et l' hypothèse de l' acquisition de la résistance par une seule et même souche . Chez un de nos patient , quatre isolats d' A. fumigatus ont été obtenus sur une période d' environ six mois . Les deux premiers , en début de traitement étaient sensibles à l' ITZ , alors que les deux derniers , isolés après plus de quatre mois de traitement étaient résistants . En effet , les résultats des tests de sensibilité in vitro ont montré une très nette augmentation des CMI pour l' ITZ de 0 , 5 µg / ml pour les isolats retrouvés avant la mise en route du traitement , à > 16 µg / ml pour les isolats retrouvés après 4 à 5 mois de traitement par ITZ . Les résultats des sensibilités in vitro ont été confirmés in vivo chez l' animal pour chacun des quatre isolats , dans le même modèle d' aspergillose disséminée qui avait été utilisé précédemment pour la confirmation de la résistance de novo à l' ITZ de la souche AF 1422 . Il est à noter que bien qu' il y ait une bonne corrélation entre les résultats in vitro et in vivo chez l' animal , l' efficacité thérapeutique chez le patient est difficile à évaluer . En effet l' absence d' amélioration clinique sous traitement par ITZ , peut être liée à la résistance du champignon mais aussi à la pathologie sous-jacente sévère présentée par le patient . Des études récentes ont permis de détecter in vitro une résistance à l' ITZ de souches d' A. fumigatus , et cette résistance a été confirmée , pour certaines souches , dans un modèle animal d' aspergillose . Dans une de ces études quatre souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ ont été isolées chez trois patients au cours d' un traitement prolongé par ITZ . Néanmoins , il n' a pas été réalisé d' étude génotypique de ces souches et il n' est pas possible de savoir si les souches ont acquis la résistance au cours du traitement ou si les patients se sont contaminés secondairement par des souches résistantes provenant de l' environnement . Dans une autre étude trois souches d' A. fumigatus ont été isolées chez deux patients . Dans un cas la souche résistante avait été isolée avant tout traitement du patient par ITZ , indiquant une résistance de novo . Dans l' autre cas , la souche résistante avait été isolée au cours du traitement par ITZ mais était génotypiquement différente de la souche initiale , isolée avant la mise en route du traitement . Les différents isolats d' A. fumigatus obtenus chez notre patient présentaient des caractéristiques macroscopiques ( faible sporulation ) ainsi qu' une composition en stérols particulière , ce qui était en faveur de l' identité des isolats . Pour confirmer cette hypothèse nous avons réalisé un typage moléculaire de ces isolats . En effet , on sait que la diversité génotypique d' A. fumigatus est très importante . Il a été montré que les souches isolées de prélèvements respiratoires , au cours du temps , chez des patients porteurs d' aspergillome ou atteints de mucoviscidose pouvaient être distinctes sur le plan génotypique . Néanmoins , dans le cas des aspergillomes , bien que plusieurs génotypes puissent être isolés chez le même patient , un génotype prédominant est généralement retrouvé . La technique de RAPD que nous avons utilisée a été réalisée avec des conditions d' amplification et avec des amorces connues pour être discriminantes . Il a été ainsi obtenu des profils identiques pour les quatre isolats . Les caractéristiques culturales des isolats associées aux résultats du typage moléculaire indiquent très fortement l' identité de ces isolats . Il a donc ainsi été montré , pour la première fois à notre connaissance , qu' une souche d' A. fumigatus pouvait acquérir une résistance à l' ITZ chez un patient traité au long cours par cet antifongique . Ces résultats , s' ils sont confirmés chez d' autres patients , auront comme implication pratique la nécessité de surveiller la sensibilité in vitro des souches isolées de façon itérative chez des patients traités par ITZ . 6 . Résistance d' A. terreus à l' amphotéricine B La souche d' A. terreus étudiée présentait une CMI à l' AMB à 2 µg / ml et une CMI basse à l' ITZ ( 1 µg / ml ) . Néanmoins , il est à souligner que la détection in vitro de la résistance à l' AMB reste très difficile avec les techniques actuelles de détermination des CMI pour les champignons filamenteux . Il a en effet été rapporté une résistance in vivo , chez l' animal , d' une souche d' A. fumigatus alors que la CMI était basse in vitro . De plus , une mauvaise corrélation in vitro - in vivo a été mise en évidence pour des souches d' A. flavus . La souche d' A. terreus que nous avons étudiée était très résistante in vivo à l' AMB , avec un délai et un taux de mortalité identiques à ceux des animaux témoins non traités . En revanche , l' ITZ gardait une efficacité thérapeutique satisfaisante . La mauvaise efficacité de l' AMB est en accord avec les études cliniques chez l' homme qui rapportent un très mauvais pronostic associé aux infections à A. terreus . Il est probable que la résistance in vivo à l' AMB soit liée à une résistance intrinsèque du champignon à l' antifongique et non pas à une virulence plus importante d' A. terreus par rapport à A. fumigatus . En effet , la DL90 de la souche étudiée était plus haute que celle des souches d' A. fumigatus dans notre modèle , indiquant une virulence plus faible que pour A. fumigatus . De plus , Hanson et al. trouvait une équivirulence , et non pas une virulence plus forte , entre une souche d' A. terreus et des souches d' A. fumigatus dans un modèle murin d' aspergillose , proche de celui que nous avons utilisé . L' absence de résistance croisée entre AMB et ITZ suggère qu' une association des deux antifongiques soit discutée en cas d' infection à A. terreus chez l' homme . Sur un plan plus fondamental , l' étude des stérols membranaires de la souche d' A. terreus a montré que le stérol majoritaire était l' ergostérol , ce qui exclut une modification de la voie de biosynthèse des stérols comme mécanisme de la résistance . En effet , des cas de résistance à l' AMB ont été attribué à des altérations de la synthèse des stérols chez différents champignons et chez un protozoaire , mais certains champignons résistants à l' AMB et présentant un taux d' ergostérol normal ont également été décrits . Pour ces derniers cas le mécanisme de résistance reste inconnu . En conclusion , nous avons pu montrer que : - Une souche d' A. terreus était très résistante in vivo à l' AMB alors même que la CMI n' était pas très élevée , à 2 µg / ml , ce qui souligne encore le problème de la détection in vitro de la résistance à l' AMB . - Il n' y avait pas de résistance croisée avec l' ITZ . - La résistance à l' AMB n' était pas liée à une altération des stérols membranaires , et pour cette souche le mécanisme de résistance reste inconnu . 7 . Etude biochimique des stérols membranaires Pour aborder les mécanismes responsables de la résistance à l' ITZ , nous avons déterminé la composition en stérols de souches d' A. fumigatus sensibles et résistantes . Nous avons ainsi montré que les différentes souches étudiées présentaient des compositions en stérols similaires , avec comme composé majeur , l' ergostérol . La résistance aux antifongiques azolés est devenue un problème préoccupant ces dernières années . La plupart des résistances a été observée chez les levures mais des études récentes ont décrit des résistances à l' ITZ chez A. fumigatus . Néanmoins , les mécanismes de cette résistance restent inconnus . Pour les levures , différents mécanismes ont été décrits : défaut d' accumulation intracellulaire de l' antifongique , altération ou surexpression de la 14 -& 239;& 129;& 161;-démethylase , ou inactivation de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase . Une altération de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase était à l' origine de la résistance aux azolés pour des souches de C. albicans . Ces souches étaient également résistantes à l' AMB du fait de l' absence d' ergostérol dans leur membrane . Une mutation de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase était également à l' origine d' une résistance chez Saccharomyces cerevisiae et chez Ustilago maydis . Dans ce dernier cas , le champignon accumulait des stérols intermédiaires mais restait sensible à l' AMB du fait de la persistance d' une quantité suffisante d' ergostérol . Pour les souches d' A. fumigatus résistantes à l' ITZ publiées par Denning et al. le mécanisme était une réduction intracellulaire du taux d' ITZ pour une souche , et une probable altération de la 14 -& 239;& 129;& 161;-déméthylase pour deux souches . Pour les souches que nous avons étudiées une altération de la & 239;& 129;& 132; 5 , 6 désaturase n' est probablement pas en cause . Une étude biochimique plus poussée doit être réalisée pour déterminer quel est le ou les mécanismes responsables de la résistance à l' ITZ . Conclusions Conclusions - Perspectives La réalisation de tests in vitro nous a permis de détecter certaines souches d' Aspergillus résistantes à l' ITZ . Néanmoins , la fréquence de ces résistances , probablement faible , doit être évaluée sur un plus grand nombre de souches , et une surveillance doit être réalisée pour voir si cette fréquence augmente au cours du temps . Pour cela la collaboration de plusieurs laboratoires , dans le cadre d' études multicentriques , sera probablement indispensable . L' existence de résistance à l' ITZ , doit également faire rechercher une résistance croisée à d' autres antifongiques azolés , en cours d' expérimentation , tels que le voriconazole ou le SCH 56592 . De telles études sont actuellement en cours dans le cadre du groupe EBGA . La survenue de résistance souligne également le besoin urgent de nouveaux antifongiques actifs sur les Aspergillus spp. spp. pour le traitement de l' API qui reste une maladie présentant une mortalité très élevée . La détermination des CMI pour les champignons filamenteux reste encore difficile sur le plan technique . Pour l' AMB les résistances sont difficiles à mettre en évidence , comme cela a déjà été montré pour les levures . L' utilisation d' autres milieux de culture à la place du RPMI doit être évaluée pour tenter d' améliorer la discrimination entre souches sensibles et souches résistantes à l' AMB . Pour les antifongiques azolés , la détermination des CMI par lecture visuelle reste très subjective , et il serait souhaitable d' évaluer d' autres méthodes . Il serait nécessaire de confirmer les résultats intéressants que nous avons obtenus par la lecture spectrophotométrique ainsi que d' évaluer l' utilisation d' indicateurs colorés . De nombreux travaux restent à faire pour déterminer les conditions optimales permettant d' obtenir une bonne reproductibilité inter et intra-laboratoire , pour les Aspergillus , mais aussi pour les autres champignons filamenteux . La mise au point d' une technique reproductible pour la détermination des CMI ne représente qu' une première étape , et il faut ensuite évaluer la corrélation entre CMI déterminée in vitro et activité de l' antifongique in vivo . Pour cela , les modèles animaux d' infections fongiques restent des outils irremplaçables . Néanmoins il est nécessaire , pour chaque agent pathogène étudié , de déterminer le modèle optimal permettant d' évaluer l' activité antifongique . Encore très peu de travaux ont été réalisés dans ce domaine pour les Aspergillus non- fumigatus et pour les autres champignons filamenteux . Des études multicentriques dont l' objectif est d' évaluer les corrélations in vitro - in vivo , sont actuellement en cours , ce qui souligne l' intérêt pour ces questions . C' est par exemple le cas du programme européen " Eurofung " dont plusieurs objectifs concernent l' étude des corrélations in vitro - in vivo pour les mucorales , les Fusarium , les Scedosporium , et les Aspergillus spp. spp. Du fait de la relative rareté des infections liées à ces agents pathogènes , la participation de plusieurs centres est indispensable pour pouvoir étudier un nombre de souches suffisant . Enfin , les mécanismes responsables de la résistance des Aspergillus spp. spp. à l' AMB ou à l' ITZ restent inconnus , mais plusieurs voies de recherche peuvent être explorées . Pour plusieurs souches d' A. fumigatus que nous avons étudiées , une altération des stérols membranaires ne semble pas en cause , tandis que cela est le cas chez d' autres champignons . Plusieurs mécanismes de résistances ont été étudiés pour certains champignons , en particulier pour les Candida spp. spp. Ainsi a -t-il pu être montré que la résistance à l' ITZ pouvait être liée à un efflux actif de l' antifongique . Ce type de mécanisme a également été mis en évidence pour une souche d' A. fumigatus d' origine clinique et très récemment pour certains mutants générés au laboratoire . Les autres mécanismes possibles peuvent être une surexpression ou une mutation de la 14 & 239;& 129;& 161;-déméthylase . La résistance des champignons filamenteux et en particulier des Aspergillus spp. spp. aux antifongiques actuellement disponibles et à ceux en cours de développement représente un vaste champ d' étude . De nombreux travaux restent à faire tant sur le plan technique ( détermination des CMI ) , sur le plan clinique ( corrélation in vitro - in vivo ) , que sur le plan fondamental ( mécanismes de résistance ) . Annexes Annexe 1 . Modèle respiratoire d' aspergillose pulmonaire invasive - Matériels et méthodes Animaux Des souris femelles non consanguines âgées de 5 à 7 semaines et pesant 20 à 22 g ont été utilisées pour toutes les expérimentations . Les souris étaient nourries avec des aliments stériles et l' eau était supplémentée en antibiotiques ( doxycycline 500 mg / l ) . Les cages étaient protégées par des couvercles filtrants . Immunodépression L' immunodépression a été obtenue par un traitement neutropéniant par le cyclophosphamide ( ENDOXAN ASTA& 194;& 174; , ASTA-MEDICA Mérignac ) par une injection intrapéritonéale de 200 mg / kg à J- 4 avant l' infection , suivie d' injections répétées de 100 mg / kg tous les 4 jours , ce schéma permettant d' obtenir une neutropénie persistante . Infection Les souches étudiées ont été cultivées sur Malt à 37 °C pendant 5 jours . La suspension de spores était préparée le jour de l' infection par lavage de la surface de la culture par 1 ml de sérum physiologique contenant 0 , 05 % de Tween 80 . Une série de dilutions de 10 en 10 a été réalisée dans du sérum physiologique contenant 0 , 05 % de Tween 80 , de 1 / 10 à 1 / 109 . La numération des spores a été faite par comptage à la cellule de Mallassez . La viabilité a été déterminée par ensemencement de 100 µl des dilutions 1 / 104 à 1 / 109 sur Sabouraud , et les colonies étaient comptées à 24h , 48h , et 72h . Le nombre de spores viables ayant servi à l' infection a été ainsi calculé . La viabilité était comprise entre 70 et 100 % suivant les souches . L' infection des animaux a été faite par inoculation de la suspension calibrée de spores d' Aspergillus par voie intranasale sous un volume de 25 µl , à la pipette Gilsonâ . Après anesthésie des animaux qui était obtenue par un mélange kétamine 75 mg / kg , diazépam 2 , 25 mg / kg et atropine 0 , 75 mg / kg les spores étaient injectées par voie intrapéritonéale sous 60 µl . Après infection les souris ont été randomisées dans les différents groupes . Traitement Le traitement a été fait par ITZ ( SPORANOX suspension buvable& 194;& 174; , Janssen ) per os , à la dose de 50 mg / kg / j et/ou 100 mg / kg / j administré par gavage en deux doses quotidiennes . L' AMB ( FUNGIZONE& 194;& 174; , Squibb ) a été administré par injection intrapéritonéale une fois par jour à la dose de 4 , 5 mg / kg / j . Le traitement était débuté 2h après l' infection et poursuivi pendant 10 jours . La mortalité a été évaluée deux fois par jour sur une période totale d' expérimentation de 21 jours . Les souris décédées étaient autopsiées ; les reins , les poumons et le cerveau ont été prélevés . Les organes ont été pesés , broyés dans 3 ml de sérum physiologique à l' aide d' un broyeur électrique . La suspension obtenue , ainsi que deux dilutions au 1 / 10 et au 1 / 100 ont été ensemencées sous 100 µl sur Sabouraud en boite . Les boites ont été conservées 3j pour les animaux non traités et 5j pour les animaux traités ; le nombre de colonies a été déterminé chaque jour . Le nombre de CFU par gramme d' organe a ainsi été déterminé . A la fin de l' expérimentation ( J22 ) les animaux survivants ont été euthanasiés et les organes traités de la même façon que pour les souris décédées spontanément . Pour certaines expérimentations des dosages d' AMB dans le sérum et dans les organes ont été effectués par HPLC . Annexe 2 . Structure et propriétés de l' itraconazole et de l' amphotéricine B Itraconazole : Propriétés : triazole , insoluble dans l' eau Principal mécanisme d' action : inhibition de la 14 -& 239;& 129;& 161;-déméthylase Nom commercial , présentation : SPORANOX& 194;& 174; , gélules Laboratoire : Janssen Pharmaceutica Autres formes galéniques : Suspension buvable Amphotéricine B : Propriétés : macrolide polyénique , lipophile insoluble dans l' eau , photosensible Principal mécanisme d' action : liaison à l' ergostérol Nom commercial , présentation : FUNGIZONE& 194;& 174; ( désoxycholate ) , solution injectable Laboratoire : Bristol-Myers Squibb Autres formes galéniques : Formulations lipidiques Annexe 3 . Voie de synthèse schématique de l' ergostérol Annexe 4 . EBGA Network EBGA Network : European research group on Biotypes and Genotypes of A spergillus fumigatus . European Concerted Action n° BMH4-CT-97 BMH4-CT-97 - 2481 , 1997 - 2000 . Coordonator : Renée GRILLOT . Objectifs du groupe EBGA : 1 . Aspergillose invasive et polymorphisme génétique de souches cliniques et environnementales d' A. fumigatus . 2 . Aspergillose invasive : sources de contamination et décontamination des locaux . 3 . Aspergillose invasive et chimioprophylaxie : sensibilité de souches cliniques d' A. fumigatus aux antifongiques systémiques . Objectif final : mise en place de recommandations , au niveau européen , pour la prévention de l' aspergillose invasive Une partie de notre travail a été réalisé dans le cadre de l' objectif 3 du groupe EBGA . Cet objectif 3 a différentes finalités : 3.1 . Mise au point d' une méthode standardisée pour les tests de sensibilité in vitro d' A. fumigatus à cinq antifongiques : AMB , ITZ , voriconazole , terbinafine , et SCH 56592 . 3.2 . Test de sensibilité in vitro des isolats cliniques d' A. fumigatus de la collection du groupe EBGA . 3.3 . Mise au point d' un modèle animal d' aspergillose pour confirmer les résistances détectées in vitro . 3.4 . Corrélation entre résistance aux antifongiques et génotype . Références bibliographiques 1 . Allendoerfer R , Loebenberg D , Rinaldi MG , Graybill JR . Evaluation of SCH51048 in an experimental model of pulmonary aspergillosis . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 1345 - 1348 . 2 . Anaissie EJ , Karyotakis NC , Hachem R , et al. Correlation between in vitro and in vivo activity of antifungal agents against Candida species . J Infect Dis 1994 ; 170 : 384 - 389 . 3 . Aufauvre-Brown A , Cohen J , Holden DW . Use of randomly amplified polymorphic DNA markers to distinguish isolates of Aspergillus fumigatus . J Clin Microbiol 1992 ; 30 : 2991 - 2993 . 4 . Barchiesi F , Najvar LK , Luther MF , et al. Variation in fluconazole efficacy for Candida albicans strains sequentially isolated from oral cavities of patients with AIDS in an experimental murine candidiasis model . Antimicrob Agents Chemother 1996 ; 40 : 1317 - 1320 . 5 . Brajtburg J , Powderly WG , Kobayashi GS , Medoff G . Amphotericin B : current understanding of mechanisms of action . Antimicrob Agents Chemother 1990 ; 34 : 183 - 188 . 6 . Broughton MC , Bard M , Lees ND . Polyene resistance in ergosterol producing strains of Candida albicans . Mycoses 1991 ; 34 : 75 - 83 . 7 . Chazalet V , Debeaupuis JP , Sarfati J , et al. Molecular typing of environmental and patient isolates of Aspergillus fumigatus from various hospital settings . J Clin Microbiol 1998 ; 36 : 1494 - 1500 . 8 . Chryssanthou E . In vitro susceptibility of respiratory isolates of Aspergillus species to itraconazole and amphotericin B. Acquired resistance to itraconazole . Scand J Infect Dis 1997 ; 29 : 509 - 512 . 9 . Currie B , Sanati H , Ibrahim AS , et al. Sterol compositions and susceptibilities to amphotericin B of environmental Cryptococcus neoformans isolates are changed by murine passage . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 1934 - 1937 . 10 . Denning DW . Invasive aspergillosis . Clin Infect Dis 1998 ; 26 : 781 - 803 . 11 . Denning DW , Hall L , Jackson M , Hollis S . Efficacy of D0870 compared with those of itraconazole and amphotericin B in two murine models of invasive aspergillosis . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 1809 - 1814 . 12 . Denning DW , Hanson LH , Perlman AM , Stevens DA . In vitro susceptibility and synergy studies of Aspergillus species to conventional and new agents . Diagn Microbiol Infect Dis 1992 ; 15 : 21 - 34 . 13 . Denning DW , Marinus A , Cohen J , et al. An EORTC multicentre prospective survey of invasive aspergillosis in haematological patients : diagnosis and therapeutic outcome . EORTC Invasive Fungal Infections Cooperative Group . J Infect 1998 ; 37 : 173 - 180 . 14 . Denning DW , Radford SA , Oakley KL , et al. Correlation between in-vitro susceptibility testing to itraconazole and in-vivo outcome of Aspergillus fumigatus infection . J Antimicrob Chemother 1997 ; 40 : 401 - 414 . 15 . Denning DW , Shankland GS , Stevens DA . DNA fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates from patients with aspergilloma . J Med Vet Mycol 1991 ; 29 : 339 - 342 . 16 . Denning DW , Stevens DA . Efficacy of cilofungin alone and in combination with amphotericin B in a murine model of disseminated aspergillosis . Antimicrob Agents Chemother 1991 ; 35 : 1329 - 1333 . 17 . Denning DW , Venkateswarlu K , Oakley KL , et al. Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus . Antimicrob Agents Chemother 1997 ; 41 : 1364 - 1368 . 18 . Dixon DM , Polak A , Walsh TJ . Fungus dose-dependent primary pulmonary aspergillosis in immunosuppressed mice . Infect Immun 1989 ; 57 : 1452 - 1456 . 19 . Dromer F , Dupont B . The increasing problem of fungal infections in the immunocompromised host . J Mycol Med 1996 ; 6 ( Suppl . 1 ) : 1 - 6 . 20 . Epstein SM , Verney E , Miale TD , Sidransky H . Studies on the pathogenesis of experimental pulmonary aspergillosis . Am J Pathol 1967 ; 51 : 769 - 788 . 21 . Espinel-Ingroff A , Bartlett M , Bowden R , et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi . J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 139 - 143 . 22 . Espinel-Ingroff A , Dawson K , Pfaller M , et al. Comparative and collaborative evaluation of standardization of antifungal susceptibility testing for filamentous fungi . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 314 - 319 . 23 . Espinel-Ingroff A , Rodriguez-Tudela JL , Martinez-Suarez JV . Comparison of two alternative microdilution procedures with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro testing of fluconazole- resistant and -susceptible isolates of Candida albicans . J Clin Microbiol 1995 ; 33 : 3154 - 3158 . 24 . Georgopapadakou NH , Walsh TJ . Human mycoses : drugs and targets for emerging pathogens . Science 1994 ; 264 : 371 - 373 . 25 . Girardin H , Sarfati J , Kobayashi H , Bouchara JP , Latge JP . Use of DNA moderately repetitive sequence to type Aspergillus fumigatus isolates from aspergilloma patients . J Infect Dis 1994 ; 169 : 683 - 685 . 26 . Graybill JR , Ahrens J . Itraconazole treatment of murine aspergillosis . Sabouraudia 1985 ; 23 : 219 - 223 . 27 . Graybill JR , Kaster SR . Experimental murine aspergillosis . Comparison of amphotericin B and a new polyene antifungal drug , SCH 28191 . Am Rev Respir Dis 1984 ; 129 : 292 - 295 . 28 . Graybill JR , Kaster SR , Drutz DJ . Treatment of experimental murine aspergillosis with BAY n 7133 . J Infect Dis 1983 ; 148 : 898 - 906 . 29 . Hanson LH , Clemons KV , Denning DW , Stevens DA . Efficacy of oral saperconazole in systemic murine aspergillosis . J Med Vet Mycol 1995 ; 33 : 311 - 317 . 30 . Hata K , Kimura J , Miki H , et al. Efficacy of ER- 30346 , a novel oral triazole antifungal agent , in experimental models of aspergillosis , candidiasis , and cryptococcosis . Antimicrob Agents Chemother 1996 ; 40 : 2243 - 2247 . 31 . Hata K , Kimura J , Miki H , et al. In vitro and in vivo antifungal activities of ER- 30346 , a novel oral triazole with a broad antifungal spectrum . Antimicrob Agents Chemother 1996 ; 40 : 2237 - 2242 . 32 . Hennequin C , Benailly N , Silly C , et al. In vitro susceptibilities to amphotericin B , itraconazole , and miconazole of filamentous fungi isolated from patients with cystic fibrosis . Antimicrob Agents Chemother 1997 ; 41 : 2064 - 2066 . 33 . Hitchcock CA , Barrett-Bee KJ , Russell NJ . The lipid composition and permeability to azole of an azole- and polyene-resistant mutant of Candida albicans . J Med Vet Mycol 1987 ; 25 : 29 - 37 . 34 . Iwen PC , Rupp ME , Langnas AN , Reed EC , Hinrichs SH . Invasive pulmonary aspergillosis due to Aspergillus terreus : 12- year experience and review of the literature . Clin Infect Dis 1998 ; 26 : 1092 - 1097 . 35 . Jahn B , Stuben A , Bhakdi S . Colorimetric susceptibility testing for Aspergillus fumigatus : comparison of menadione-augmented 3 - ( 4 , 5- dimethyl- 2- thiazolyl ) - 2 , 5 - diphenyl- 2H -tetrazolium bromide and Alamar blue tests . J Clin Microbiol 1996 ; 34 : 2039 - 2041 . 36 . Joseph-Horne T , Loeffler RS , Hollomon DW , Kelly SL . Amphotericin B resistant isolates of Cryptococcus neoformans without alteration in sterol biosynthesis . J Med Vet Mycol 1996 ; 34 : 223 - 225 . 37 . Joseph-Horne T , Manning N , Holoman D , Kelly S . Nonsterol related resistance in Ustilago maydis to the polyene antifungals , amphotericin B and nystatin . Phytochemistry 1996 ; 42 : 637 - 639 . 38 . Joseph-Horne T , Manning NJ , Hollomon D , Kelly SL . Defective sterol delta 5 ( 6 ) desaturase as a cause of azole resistance in Ustilago maydis . FEMS Microbiol Lett 1995 ; 127 : 29 - 34 . 39 . Kelly SL , Lamb DC , Corran AJ , Baldwin BC , Kelly DE . Mode of action and resistance to azole antifungals associated with the formation of 14 alpha-methylergosta- 8 , 24 ( 28 ) -dien- 3 beta , 6 alpha-diol . Biochem Biophys Res Commun 1995 ; 207 : 910 - 915 . 40 . Kelly SL , Lamb DC , Kelly DE , Loeffler J , Einsele H . Resistance to fluconazole and amphotericin in Candida albicans from AIDS patients . Lancet 1996 ; 348 : 1523 - 1524 . 41 . Kelly SL , Lamb DC , Taylor M , et al. Resistance to amphotericin B associated with defective sterol delta 8 -- 7 isomerase in a Cryptococcus neoformans strain from an AIDS patient . FEMS Microbiol Lett 1994 ; 122 : 39 - 42 . 42 . Khoo SH , Denning DW . Invasive aspergillosis in patients with AIDS . Clin Infect Dis 1994 ; 19 Suppl 1 : S41 - 48 . 43 . Kim SJ , Kwon-Chung KJ , Milne GW , Prescott B . Polyene-resistant mutants of Aspergillus fennelliae : identification of sterols . Antimicrob Agents Chemother 1974 ; 6 : 405 - 410 . 44 . Lass-Florl C , Kofler G , Kropshofer G , et al. In-vitro testing of susceptibility to amphotericin B is a reliable predictor of clinical outcome in invasive aspergillosis . J Antimicrob Chemother 1998 ; 42 : 497 - 502 . 45 . Latge JP . Aspergillus fumigatus and aspergillosis . Clin Microbiol Rev 1999 ; 12 : 310 - 350 . 46 . Law D , Moore CB , Denning DW . Amphotericin B resistance testing of Candida spp. : a comparison of methods . J Antimicrob Chemother 1997 ; 40 : 109 - 112 . 47 . Loudon KW , Burnie JP , Coke AP , Matthews RC . Application of polymerase chain reaction to fingerprinting Aspergillus fumigatus by random amplification of polymorphic DNA . J Clin Microbiol 1993 ; 31 : 1117 - 1121 . 48 . Manavathu EK , Alangaden GJ , Lerner SA . A comparative of the broth micro- and macro-dilution techniques for the determination of the in vitro susceptibility of Aspergillus fumigatus . Can J Microbiol 1996 ; 42 : 960 - 964 . Mechanism of amphotericin B resistance in Leishmania donovani promastigotes . Antimicrob Agents Chemother 1998 ; 42 : 352 - 357 . 50 . National Committee for Clinical Laboratory Standards . Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts . Proposed standard M-27P . NCCLS , Villanova , PA , 1992 . 51 . National Committee for Clinical Laboratory Standards . Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts . M-27A . NCCLS , Villanova , PA , 1995 . 52 . National Committee for Clinical Laboratory Standards . Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of conidium-forming filamentous fungi ; proposed standard . M-38P . NCCLS , Villanova , PA , 1998 . 53 . Nguyen MH , Yu CY . Influence of incubation time , inoculum size , and glucose concentrations on spectrophotometric endpoint determinations for amphotericin B , fluconazole , and itraconazole . J Clin Microbiol 1999 ; 37 : 141 - 145 . 54 . Nolte FS , Parkinson T , Falconer DJ , et al. Isolation and characterization of fluconazole- and amphotericin B- resistant Candida albicans from blood of two patients with leukemia . Antimicrob Agents Chemother 1997 ; 41 : 196 - 199 . 55 . Oakley KL , Moore CB , Denning DW . In-vitro activity of voriconazole against Aspergillus spp. and comparison with itraconazole and amphotericin B . J Antimicrob Chemother 1998 ; 42 : 91 - 94 . 56 . Odds FC , Van Gerven F , Espinel-Ingroff A , et al. Evaluation of possible correlations between antifungal susceptibilities of filamentous fungi in vitro and antifungal treatment outcomes in animal infection models . Antimicrob Agents Chemother 1998 ; 42 : 282 - 288 . 57 . Odds FC , Vranckx L , Woestenborghs F . Antifungal susceptibility testing of yeasts : evaluation of technical variables for test automation . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 2051 - 2060 . 58 . Parkinson T , Falconer DJ , Hitchcock CA . Fluconazole resistance due to energy-dependent drug efflux in Candida glabrata . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 1696 - 1699 . 59 . Pfaller MA , Messer SA , Coffmann S . Comparison of visual and spectrophotometric methods of MIC endpoint determinations by using broth microdilution methods to test five antifungal agents , including the new triazole D0870 . J Clin Microbiol 1995 ; 33 : 1094 - 1097 . 60 . Pfaller MA , Rex JH , Rinaldi MG . Antifungal susceptibility testing : technical advances and potential clinical applications . Clin Infect Dis 1997 ; 24 : 776 - 784 . 61 . Polak A . Experimental models in antifungal chemotherapy . Mycoses 1998 ; 41 : 1 - 30 . 62 . Rath PM . Susceptibility of Aspergillus strains from culture collections to amphotericin B and itraconazole . J Antimicrob Chemother 1998 ; 41 : 567 - 570 . 63 . Richardson MD , Kokki MH . Antifungal therapy in ' bone marrow failure ' . Br J Haematol 1998 ; 100 : 619 - 628 . 64 . Rodriguez-Tudela JL , Berenguer J , Martinez-Suarez JV , Sanchez R . Comparison of a spectrophotometric microdilution method with RPMI- 2 % glucose with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro susceptibility testing of amphotericin B , flucytosine , and fluconazole against Candida albicans . Antimicrob Agents Chemother 1996 ; 40 : 1998 - 2003 . 65 . Rodriguez-Tudela JL , Martinez-Suarez JV . Defining conditions for microbroth antifungal susceptibility tests : influence of RPMI and RPMI- 2 % glucose on the selection of endpoint criteria . J Antimicrob Chemother 1995 ; 35 : 739 - 749 . 66 . Rogers TE , Galgiani JN . Activity of fluconazole ( UK 49 , 858 ) and ketoconazole against Candida albicans in vitro and in vivo . Antimicrob Agents Chemother 1986 ; 30 : 418 - 422 . 67 . Ruhnke M , Eigler A , Tennagen I , et al. Emergence of fluconazole-resistant strains of Candida albicans in patients with recurrent oropharyngeal candidosis and human immunodeficiency virus infection . J Clin Microbiol 1994 ; 32 : 2092 - 2098 . 68 . Sanati H , Messer SA , Pfaller M , et al. Multicenter evaluation of broth microdilution method for susceptibility testing of Cryptococcus neoformans against fluconazole . J Clin Microbiol 1996 ; 34 : 1280 - 1282 . 69 . Sanglard D , Kuchler K , Ischer F , et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters . Antimicrob Agents Chemother 1995 ; 39 : 2378 - 2386 . 70 . Sheehan DJ , Hitchcock CA , Sibley CM . Current and emerging azole antifungal agents . Clin Microbiol Rev 1999 ; 12 : 40 - 79 . 71 . Sokol-Anderson M , Sligh JE , Jr. , Elberg S , et al. Role of cell defense against oxidative damage in the resistance of Candida albicans to the killing effect of amphotericin B . Antimicrob Agents Chemother 1988 ; 32 : 702 - 705 . 72 . Stevens DA . Animal model in the evaluation of antifungal drugs . J Mycol Med 1996 ; 6 ( Suppl . 1 ) : 7 - 10 . 73 . Valentin A , Le Guennec R , Rodriguez E , et al. Comparative resistance of Candida albicans clinical isolates to fluconazole and itraconazole in vitro and in vivo in a murine model . Antimicrob Agents Chemother 1996 ; 40 : 1342 - 1345 . 74 . Vanden Bossche H. Itraconazole : a selective inhibitor of the cytochrome P- 450 dependent ergosterol biosynthesis . In : Fromtling R , ed . Recent trends in the discovery , development and evaluation of antifungal agents : Prous science publishers , 1987 : 39 - 53 75 . Vanden Bossche H , Dromer F , Improvisi I , et al. Antifungal drug resistance in pathogenic fungi . Med Mycol 1998 ; 36 Suppl 1 : 119 - 128 . 76 . Venkateswarlu K , Denning DW , Manning NJ , Kelly SL . Resistance to fluconazole in Candida albicans from AIDS patients correlated with reduced intracellular accumulation of drug . FEMS Microbiol Lett 1995 ; 131 : 337 - 341 . 77 . Verweij PE , Denning DW . Diagnostic and therapeutic strategies for invasive aspergillosis . Seminars in respiratory and critical care medecine 1997 ; 18 : 203 - 215 . 78 . Verweij PE , Meis JF , Sarfati J , et al. Genotypic characterization of sequential Aspergillus fumigatus isolates from patients with cystic fibrosis . J Clin Microbiol 1996 ; 34 : 2595 - 2597 . 79 . Verweij PE , Mensink M , Rijs AJ , et al. In-vitro activities of amphotericin B , itraconazole and voriconazole against 150 clinical and environmental Aspergillus fumigatus isolates . J Antimicrob Chemother 1998 ; 42 : 389 - 392 . 80 . Verweij PE , Oakley KL , Morrissey J , Morrissey G , Denning DW . Efficacy of LY303366 against amphotericin B-susceptible and -resistant Aspergillus fumigatus in a murine model of invasive aspergillosis . Antimicrob Agents Chemother 1998 ; 42 : 873 - 878 . 81 . Verweij PE , Voss A , Meis JF . Resistance of Aspergillus fumigatus to itraconazole . Scand J Infect Dis 1998 ; 30 : 642 - 643 . 82 . Watson PF , Rose ME , Ellis SW , England H , Kelly SL . Defective sterol C5 - 6 desaturation and azole resistance : a new hypothesis for the mode of action of azole antifungals . Biochem Biophys Res Commun 1989 ; 164 : 1170 - 1175 . 83 . White TC , Marr KA , Bowden RA . Clinical , cellular , and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance . Clin Microbiol Rev 1998 ; 11 : 382 - 402 .