_: A Gabriel , Sem você , nada disso teria sido possível . Sans toi , rien de tout cela n' aurait été possible . Há homens que lutam um dia , e são bons ; Enfin , mon merci le plus spécial , je l' adresse à mes parents , surtout à mon père , pour leur support inconditionnel pendant toutes ces années , pour les bonnes discussions ( au téléphone ) pendant les moments difficiles ... Dans un premier temps , nous avons donc montré qu' EWI- 2 wint , un nouveau partenaire de CD81 , est exprimé dans différentes lignées cellulaires mais pas dans les hépatocytes . L' anticorps MT 81w , qui reconnaît uniquement CD81 associée aux TEM , n' inhibait pas l' infection et la déplétion des cellules en cholestérol , qui inhibe l' infection , n' affectait pas les niveaux de CD81 associée aux TEM . In our study , we analysed the role of CD81 and its associated proteins in HCV entry mechanism . Interestingly , ectopic expression of mouse CD81 ( mCD 81 ) in Huh- 7 w 7 cells was also able to restore HCV permissivity , indicating that mCD 81 in the context of human hepatocytes mimicks hCD 81 in HCV entry and likely in interactions with cellular factors . ADNc & 226;& 128;& 147; ADN complémentaire Des êtres qui luttent pendant longtemps , et c' est très bien ; Puis , il y a ceux qui luttent toute une vie Ce sont eux , les indispensables Berthold Brecht REMERCIEMENTS Tout d' abord je voudrais remercier Laurence pour ces quatre années passées au laboratoire , pour son orientation et support . Elle a été extrêmement importante pour ma formation dans la recherche et pour le développement de mon raisonnement scientifique . Encore une fois merci . Merci aux membres de mon jury de thèse : Claude Boucheix , François Loïc Cosset , Didier Hober , Annie Cahour et Jamal Khalife , pour l' intérêt qu' ils ont porté à mes travaux . Merci à Jean de m' avoir acceptée dans son laboratoire ainsi que d' être un chef accessible . Son aide était importante , surtout pour la fusion des hybridomes ! Merci à mon ancien demi-chef , Czeslaw , pour les discussions / monologues sur les projets , sur les résultats et sur la vie en général . Les repas et les pauses cafés étaient toujours à la fois drôles et constructifs . Merci à Sophana pour son amitié , pour les conseils informatiques et électroniques , pour les figures et surtout pour les blagues ! Merci au groupe des mange-tard , qui s' est développé au fil des années ... Laurence , Czes , Sophana , André , David , Pierre-Yves et Khaled . Un merci spécial à David pour le travail qu' on a fait ensemble et pour sa camaraderie , et un autre à André , le pape de la culture cell , des IF et des bateaux ! Merci au groupe wint , groupe des filles : Claire , Alicia , Yohanna , Birke et ... bienvenue Julie . Merci à Muriel pour le travail et l' amitié pendant toutes ces années , et à Pauline pour le support technique , essentiel pendant la production d' anticorps . A quatre mains c' est beaucoup plus facile ... Merci à Lucie pour tous les moments d' amusement et pour toutes les vannes , et à Yves pour les questions et remarques toujours pertinentes et , bien sûr , pour les mauvaises blagues . Merci à toute l' équipe HCV , passée et présente : Merci à Julie Bertout pour l' utilisation du cytomètre à flux , à Hervé Drobecq pour la spectrométrie de masse , à Marco , Thierry et Christophe pour les aides respectives pendant la conception du protocole de production d' anticorps monoclonaux , pour la réalisation des immunisations et pour les discussions sur les résultats obtenus . Merci à Eric Rubinstein et François Le Naour pour les discussion sur wint . Je remercie également mes amis brésiliens , qui de loin m' ont également supportée , par e-mail , par téléphone et parfois en venant nous rendre visite . Les vrais amis le sont jusqu'à aujourd'hui . Há outros que lutam um ano , e são melhores ; pour tout . Obrigada por serem como são . RESUME Le virus de l' hépatite C ( VHC ) touche 2 à 3 % de la population mondiale et la plupart des individus infectés développent une hépatite chronique qui est fortement associée au développement d' un cancer du foie . Bien que les mécanismes de régulation de l' entrée du VHC dans ses cellules cibles , les hépatocytes , soient encore très mal connus , plusieurs protéines de surface cellulaire ont été identifiées comme des facteurs nécessaires à l' entrée virale . Parmi ces protéines , la tétraspanine CD81 est essentielle à l' entrée du VHC . Les membres de la famille des tétraspanines ont la particularité de s' associer entre eux et avec d' autres protéines , appelées partenaires , pour former des complexes multimoléculaires dans des microdomaines appelés microdomaines enrichis en tétraspanines ( TEM ) . Dans notre étude , nous avons analysé le rôle de CD81 et de ses protéines associées dans le mécanisme d' entrée du VHC . En effet , nous avons identifié un nouveau partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , qui inhibe l' infection par le VHC , et nous avons analysé le rôle de la fraction de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le VHC . Há aqueles que lutam muitos anos , e são muito bons ; L' expression ectopique d' EWI- 2 wint dans des Huh- 7 , une lignée de cellules hépatiques susceptibles à l' infection par le VHC , bloque l' entrée virale . Nous avons pu montrer que ce blocage se fait par une inhibition de l' interaction entre CD81 et les glycoprotéines d' enveloppe présentes à la surface des particules virales . Notre travail suggère ainsi que l' hépatotropisme du VHC ne serait pas lié uniquement à la présence de facteurs d' entrée spécifiques , mais également à l' absence du facteur inhibiteur EWI- 2 wint . Ce type de mécanisme de contrôle de l' entrée virale par un inhibiteur cellulaire n' avait jamais été décrit auparavant . En parallèle , en utilisant des particules du VHC hautement infectieuses produites en culture cellulaire , nous avons isolé des clones cellulaires indépendants présentant des niveaux d' infection variables . Parmi ces clones , un clone résistant à l' infection avait perdu l' expression de CD81 ( cellules Huh- 7 w 7 ) . L' expression ectopique de la CD81 humaine ( hCD 81 ) dans ce clone a permis de restaurer la permissivité en Huh- 7 . De manière intéressante , l' expression ectopique de la CD81 d' origine murine ( mCD 81 ) dans les cellules Huh- 7 w 7 a également permis de restaurer la permissivité au virus , suggérant que la mCD 81 dans un contexte cellulaire humain est capable de mimer la hCD 81 dans le mécanisme d' entrée du VHC et probablement dans les interactions avec les facteurs cellulaires . Nous avons donc utilisé ces cellules exprimant la mCD 81 et des anticorps monoclonaux décrits précédemment , MT 81 / MT 81w , pour analyser le rôle de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le VHC . Porém há os que lutam toda a vida De manière similaire , le traitement des cellules avec de la sphingomyélinase , qui réduit l' infection , augmentait les niveaux de CD81 associée aux TEM . En résumé , nous avons montré que l' entrée du VHC dans ses cellules cibles est directement liée au niveau d' expression de CD81 et la sous-population de CD81 associée aux TEM ne semble pas participer aux étapes initiales du cycle viral du VHC . Mots clés : VHC , mécanisme d' entrée , tétraspanine , CD81 , EWI- 2 wint , TEM ABSTRACT Between 2 and 3 percent of the world population is chronically infected with hepatitis C virus ( HCV ) and thus at risk of developing liver cancer . Although precise mechanisms regulating HCV entry into hepatic cells are still unknown , several cell surface proteins have been identified as entry factors for this virus . Among these molecules , tetraspanin CD81 is essential for HCV entry . A major characteristic of tetraspanins is their ability to interact with each other and with other transmembrane proteins , thus building membrane multi-molecular complexes , collectively referred to as the tetraspanin enriched microdomains ( TEM ) . Estes são os imprescindíveis We identified a partner of CD81 , EWI- 2 wint , which inhibits HCV infection . We also analyzed the role of TEM-associated CD81 fraction in HCV infection . During the first part of this work , we showed that EWI- 2 wint , a new CD81 partner , is expressed in several cell lines but not in hepatocytes . Ectopic expression of EWI- 2 wint in Huh- 7 , a hepatoma cell line susceptible to HCV infection , blocked viral entry by inhibiting the interaction between CD81 and the HCV envelope glycoproteins present on the surface of viral particles . This finding suggests that , in addition to the presence of specific entry factors in the hepatocytes , the lack of a specific inhibitor can contribute to the hepatotropism of HCV . This is the first example of a pathogen gaining entry into host cells that lack a specific inhibitory factor . In parallel of this study , successive infections of Huh- 7 target cells with highly infectious HCV particles produced in cell culture allowed us to isolate cellular clones exhibiting different HCV infection levels . One of these cellular clones was resistant to HCV infection and had lost CD81 expression ( Huh- 7 w 7 cells ) . Ectopic expression of human CD81 ( hCD 81 ) in Huh- 7 w 7 cells restored HCV permissivity . Il y a des êtres humains qui luttent un moment , et c' est bien ; We then took advantage of these permissive cells expressing mCD 81 and the previously described MT 81 / MT 81w monoclonal antibodies to analyze the role of the TEM-associated CD81 in HCV infection . We showed that MT 81w antibody that only recognizes TEM-associated mCD 81 did not inhibit HCV infection and cholesterol depletion , which inhibits HCV infection , did not affect TEM-associated CD81 levels . Similarly , sphingomyelinase treatment , which also reduces HCV infection , raised TEM-associated CD81 levels . In summary , we showed that HCV entry is directly related to CD81 expression level in hepatoma cells and populations of CD81 associated with TEM do not seem to participate in the early steps of HCV life cycle . Keywords : HCV , entry process , tetraspanin , CD81 , EWI- 2 wint , TEM Liste des abréviations 3 ' NC & 226;& 128;& 147; extrémité 3 ' non codante 5 ' NC & 226;& 128;& 147; extrémité 5 ' non codante Des êtres qui luttent un certain temps , et c' est mieux ; ALAT & 226;& 128;& 147; alanine amino-transférase , transaminase hépatique ASAT & 226;& 128;& 147; aspartate amino-transférase , transaminase hépatique ARFP & 226;& 128;& 147; protéine F issue d' un cadre alternatif de lecture ( de l' anglais Alternating Reading Frame Protein ) BCR & 226;& 128;& 147; récepteur des cellules B ( de l' anglais B cell receptor ) CSP & 226;& 128;& 147; protéine circumsporozoïte du parasite Plasmodium ( de l' anglais circumsporozoite protein ) CDV & 226;& 128;& 147; virus de la maladie de Carré ( de l' anglais canine distemper virus ) C-terminal & 226;& 128;& 147; carboxy-terminal CLDN- 1 , - 6 , - 9 & 226;& 128;& 147; protéine des jonctions serrées , claudine- 1 , - 6 et - 9 CLDNs & 226;& 128;& 147; les claudines - 1 , - 6 et - 9 DARC & 226;& 128;& 147; récepteur de chemokines ( de l' anglais duffy antigen receptor for chemokines ) DC-SIGN & 226;& 128;& 147; lectine de type C ( de l' anglais dendritic cell specific ICAM- 3- grabbing nonintegrin ) EIAs & 226;& 128;& 147; essais immunoenzymatiques ( de l' anglais enzyme immunoassays ) Endo-H - enzyme endoglycosidase H EGF & 226;& 128;& 147; facteur de croissance épidermique ( de l' anglais epidermal growth factor ) EST & 226;& 128;& 147; banque de séquences ( de l' anglais Expressed sequence tag ) ERM & 226;& 128;& 147; protéines Ezrine , Radixine et Moesine ffu & 226;& 128;& 147; unité formant des foyers ( de l' anglais forming foci unit ) GAG & 226;& 128;& 147; glycosaminoglycanes GDD & 226;& 128;& 147; motif Gly-Asp-Asp , caractéristique des ARN polymérases ARN-dépendantes GFP & 226;& 128;& 147; protéine verte fluorescente ( de l' anglais green fluorescent protein ) GL & 226;& 128;& 147; gouttelettes lipidiques HB-EGF & 226;& 128;& 147; facteur de croissance épidermique lié à l' héparine ( de l' anglais heparin-binding epidermal growth factor ) HDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de haute densité ( de l' anglais high density lipoproteins ) HTLV- 1 & 226;& 128;& 147; virus de la leucémie humaine de cellules T ( de l' anglais human T-cell leukemia virus ) HSP & 226;& 128;& 147; protéine de choc thermique ( de l' anglais heat shock protein ) HVR & 226;& 128;& 147; région hypervariable 1 , 2 et 3 ( de l' anglais hypervariable region ) IFN- ( ? , ? ) - interféron ? , ? Ig - immunoglobuline IRES & 226;& 128;& 147; site interne d' entrée des ribosomes ( de l' anglais internal ribosome entry site ) ISG & 226;& 128;& 147; gènes stimulés par interféron ( de l' anglais interferon-stimulated genes ) JFH- 1 & 226;& 128;& 147; de l' anglais Japanese Fulminant Hepatitis , génome du VHC de génotype 2a LDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de faible densité ( de l' anglais low density lipoproteins ) LDL-R & 226;& 128;& 147; récepteur aux lipoprotéines de faible densité ( de l' anglais LDL-receptor ) LEL & 226;& 128;& 147; large boucle extracellulaire de la tétraspanine CD81 ( de l' anglais large extracellular loop ) LPL & 226;& 128;& 147; Lipoprotéine lipase L-SIGN & 226;& 128;& 147; lectine de type C ( de l' anglais liver / lymph node specific ICAM- 3- grabbing nonintegrin ) M ? CB & 226;& 128;& 147; méthyl- ? -cyclodextrine MHC-I et - II & 226;& 128;& 147; complexes majeurs d' histocompatibilité ( de l' anglais major histocompatibility complex ) MLV & 226;& 128;& 147; virus de la leucémie murine ( de l' anglais murine leukemia virus ) MT 81w & 226;& 128;& 147; anticorps monoclonal de rat anti-souris CD81 , qui reconnaît cette molécule uniquement lorsqu' elle est associée à la toile de tétraspanines MTP & 226;& 128;& 147; protéine de transfert microsomal NK & 226;& 128;& 147; cellules Natural Killer , composantes du système immunitaire inné N-terminal & 226;& 128;& 147; amino-terminal NS & 226;& 128;& 147; protéines non-structurales du virus de l' hépatite C OMS & 226;& 128;& 147; Organisation Mondiale de la Santé ORF & 226;& 128;& 147; cadre ouvert de lecture ( de l' anglais open reading frame ) PBMC & 226;& 128;& 147; cellules mononucléaires du sang périphérique ( de l' anglais peripherial blood mononuclear cells ) PKA & 226;& 128;& 147; protéine kinase A PKC & 226;& 128;& 147; protéine kinase C RE & 226;& 128;& 147; réticulum endoplasmique RFLP & 226;& 128;& 147; identification de variantes génétiques par l' utilisation d' enzymes de restriction formant des fragments avec des tailles différentes selon les génotypes et soustypes du VHC ( de l' anglais restriction fragment length polymorphism ) RT-PCR & 226;& 128;& 147; transcription reverse suivie d' une réaction en chaîne de la polymérase ( de l' anglais reverse transcription - polymerase chain reaction ) SAA & 226;& 128;& 147; lipoprotéine serum amyloïde A SCID - immunodéficience sévère combinée ( de l' anglais severe combined immunodeficiency ) sE 2 & 226;& 128;& 147; ectodomaine soluble de la glycoprotéine E2 du VHC SEL & 226;& 128;& 147; petite boucle extracellulaire de la tétraspanine CD81 ( de l' anglais small extracellular loop ) Smase & 226;& 128;& 147; enzyme sphingomyélinase SPP & 226;& 128;& 147; peptidase de peptide signal , enzyme cellulaire qui clive la protéine de capside ( de l' anglais signal peptide peptidase ) SR-BI & 226;& 128;& 147; scavenger récepteur de classe B type I SV40 & 226;& 128;& 147; virus simien 40 ( de l' anglais simian virus 40 ) TCR & 226;& 128;& 147; récepteur de cellules T ( de l' anglais T cell receptor ) TEM & 226;& 128;& 147; microdomaines enrichis en tétraspanines ( de l' anglais tetraspanin enriched microdomains ) TGF- ? - facteur ? de croissance de tumeur ( de l' anglais tumor growth factor- ? ) Th & 226;& 128;& 147; lymphocyte T auxiliaire ( de l' anglais T helper ) TIMP- 1 & 226;& 128;& 147; protéine inhibitrice des métalloprotéases ( de l' anglais tissue inhibitor of metalloproteinases ) TLR & 226;& 128;& 147; récepteurs toll-like ( de l' anglais toll-like receptors ) TMD & 226;& 128;& 147; domaine transmembranaire ( de l' anglais transmembrane domain ) TRAP & 226;& 128;& 147; protéine anonyme associée à la thrombospondine , du parasite Plasmodium ( de l' anglais thrombospondin-related anonymous protein ) VCAM- 1 - molécule vasculaire d' adhésion cellulaire- 1 ( de l' anglais vascular cell-adhesion molecule ) VIF & 226;& 128;& 147; virus de l' immunodéficience féline VHC & 226;& 128;& 147; virus de l' hépatite C VHCcc & 226;& 128;& 147; VHC produit en culture cellulaire VHCpp & 226;& 128;& 147; particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d' enveloppe du VHC VIH & 226;& 128;& 147; virus de l' immunodéficience humaine VLDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de très faible densité ( de l' anglais very low density lipoproteins ) VLP & 226;& 128;& 147; particules ressemblant au VHC ( de l' anglais virus-like particles ) INTRODUCTION I. L' Hépatite C 1 . La découverte de l' agent responsable de la maladie Pendant les années 70 , l' incidence des hépatites A et B post-transfusionnelles était en baisse due aux mesures de prévention , néanmoins un grand nombre de cas ne présentant aucun marqueur sérologique spécifique aux virus hépatotropes connus à l' époque était encore détecté . Pour cela , l' expression « hépatite post-transfusionnelle non-A non-B » a été proposée afin de décrire une forme d' hépatite qui n' était pas liée aux infections par le virus de l' hépatite A ni celui de l' hépatite B ( Lemon , 2007 ) . La première référence à un virus pouvant être l' agent étiologique de ces hépatites post-transfusionnelles non-A non-B a été publiée en 1974 ( Prince et al. , 1974 ) . La nature virale de l' agent infectieux a été finalement établie à la fin des années 70 grâce à des études d' infection expérimentale de chimpanzés ( Alter et al. , 1978a ; Bradley et al. , 1981 ; Tabor et al. , 1978 ) . Avec le succès de ces infections , Choo et collaborateurs ont décrit le clonage moléculaire d' une souche virale isolée à partir d' un chimpanzé infecté ( Choo et al. , 1989 ) . Leur étude a permis d' identifier les caractéristiques moléculaires de l' agent infectieux viral , sans que celui  -ci n' ait été isolé ou cultivé . Ce virus a été appelé Virus de l' Hépatite C ( VHC ) et la maladie qu' il cause , Hépatite C . 2 . L' épidemiologie 2.1 . La prévalence de l' infection à travers le monde Selon l' Organisation Mondiale de la Santé ( OMS ) , environ 2 , 2 % de la population mondiale , soit 130 millions d' individus , sont infectés par le VHC ( Lemon , 2007 ) . L' hépatite C est une maladie chronique grave avec une prévalence variable d' un continent à l' autre . Dans les pays développés , les taux de prévalence des anticorps anti-VHC sont généralement inférieurs à 2 % . La France , par exemple , présente une prévalence estimée à 1 % de la population générale ( Bastie et al. , 1995 ; Dubois et al. , 1997 ; Martinot-Peignoux et al. , 1999 ; Payan et al. , 2005 ) . Par contre , dans certains pays , comme l' Egypte ( Memon and Memon , 2002 ) ou certaines régions de l' Italie ( Raffaele et al. , 2001 ) , la prévalence peut atteindre 20 % ( Figure 1 ) . Figure 1 . La prévalence du VHC à travers le monde . ( d' après WHO , Wkly . Epidemiol . Rec . 2002 ) . 2.2 . Les modes de contamination La transmission du VHC est essentiellement parentérale . Avant le développement des tests sérologiques pour le tri des donneurs de sang , les transfusions de sang et de ses dérivés , ainsi que la transplantation d' organes , étaient les principales voies de transmission du VHC . Actuellement , dans les pays développés , la majorité des cas sont associés à la toxicomanie intraveineuse ( Lemon , 2007 ) . En effet , la prévalence des anticorps anti-VHC varie de 30 % à 98 % dans la population toxicomane européenne ( Roy et al. , 2002 ) . L' incidence annuelle de contamination entre les toxicomanes par voie intraveineuse varie entre 15 % et 30 % . Par contre , dans la population générale la moyenne d' incidence de séroconversion anti-VHC à partir d' une exposition accidentelle au sang contaminé est de 1 , 8 % . Chez les professionnels de la santé , ce taux n' est pas très différent , il varie de 1 % à 2 % ( Lemon , 2007 ) . Dans les pays en développement , plusieurs cas d' infection sont corrélés à des injections thérapeutiques et aux transfusions de sang réalisées dans des mauvaises conditions d' asepsie . D' autres pratiques , telles que l' acupuncture , le tatouage ou le piercing , peuvent également représenter un risque de transmission si elles ne sont pas réalisées dans de bonnes conditions d' asepsie ( Lemon , 2007 ) . En effet , la contamination nosocomiale relève essentiellement de l' utilisation de matériel mal désinfecté . Les transmissions par voie périnatale , sexuelle ou familiale sont relativement peu fréquentes ( Lemon , 2007 ) . Il est à noter que pour 30 à 40 % des personnes infectées , aucune voie de contamination n' a été identifiée . 3 . Les techniques de diagnostic Le sérum ou plasma des patients est utilisé pour le diagnostic de l' infection par le VHC . Celui ci est réalisé par des techniques sérologiques , de détection d' anticorps dirigés contre les protéines virales , et par des techniques de biologie moléculaire , de détection d' acides nucléiques viraux . Les tests sérologiques utilisés sont des tests immunoenzymatiques ( EIAs ) , basés sur la technique d' immunoblot ou sur la détection d' anticorps spécifiques contre les différents génotypes du virus ( Pawlotsky , 1999 ) . Ces anticorps sont les marqueurs indirects d' une infection par le VHC et sont détectables à partir de sept ou huit semaines après l' infection . Il existe différents tests commerciaux de ce type , basés sur la détection d' anticorps dirigés contre différentes protéines virales ( capside , NS4 et NS5 , principalement ) ( Berenguer , 2002 ) . Ces tests sont très sensibles et permettent l' analyse d' un grand nombre d' échantillons . En général , les résultats positifs doivent être confirmés par la détection du génome viral . L' ARN génomique est le marqueur qui apparait le plus rapidement après la contamination . Les tests moléculaires pour la détection du génome ARN du VHC sont très importants pour le diagnostic des cas d' hépatite aiguë , mais aussi pour la confirmation d' une hépatite chronique après détection d' anticorps anti-VHC et pour contrôler la réponse à une thérapie antivirale . Ces tests sont également réalisés en cas d' exposition du personnel soignant au sang et pour la démonstration d' une transmission périnatale du VHC ( Pawlotsky , 2002 ) . Les méthodes de biologie moléculaire incluent des tests qualitatifs pour la détection de l' ARN viral présent dans les fluides corporels , et des tests quantitatifs pour la détermination de la charge virale . Ces derniers sont importants pour la détermination indirecte du niveau de réplication virale dans le foie ( Lemon , 2007 ) . Différentes techniques de détection de l' ARN génomique sont utilisées , comme la RT-PCR ( transcription reverse suivie d' une réaction en chaîne de la polymérase ) . Cependant , l' utilisation clinique des tests quantitatifs est réservée au suivi de la réponse à une thérapie antivirale . En plus de la détection et quantification de l' ARN viral , des techniques moléculaires sont disponibles pour déterminer le génotype du VHC , notamment chez les patients candidats à une thérapie antivirale . Il existe des techniques de séquençage direct de la région 5 ' non codante du génome et d' amplification de séquences codantes de la protéine de capside avec des oligonucléotides spécifiques pour les différents génotypes ( Lemon , 2007 ) . Une autre technique utilisée est l' identification de variants génétiques par l' utilisation d' enzymes de restriction , qui génèrent des fragments de tailles différentes selon les génotypes et sous-types ( RFLP & 226;& 128;& 147; polymorphisme de fragments d' enzymes de restriction ) ( Anderson et al. , 2003 ; Thiers et al. , 1997 ) . 4 . La pathogenèse de l' infection Le foie est l' organe majeur de réplication du VHC . Dans les tissus collectés de patients infectés , entre 5 à 50 % des hépatocytes présentent de l' ARN viral et des protéines virales ( Nouri-Aria et al. , 1995 ; Pal et al. , 2006 ) . Chez quelques patients , presque toutes les cellules hépatocytaires contiennent de l' ARN . Cependant , certaines études montrent que la présence du virus n' est pas limitée aux hépatocytes et que l' ARN et les antigènes peuvent être détectés dans les cellules mononuclées , dans l' épithélium biliaire , dans les cellules sinusoïdes et dans l' épithélium intéstinal ( Deforges et al. , 2004 ; Nouri-Aria et al. , 1995 ; Pal et al. , 2006 ) . L' ARN du VHC est détecté par RT-PCR dans les cellules mononuclées du sang périphérique ( PBMC ) , les ganglions , la rate , le cerveau , le pancréas , la moelle épinière , les glandes surénales et la thyroïde ( Forton et al. , 2004 ; Lerat et al. , 1998 ) . Par contre , il n' est pas connu si le virus se réplique réellement dans ces tissus . En culture cellulaire , il a été montré que le VHC est capable de se répliquer dans les cellules lymphoïdes ( Sung et al. , 2003 ) , avec la sélection de mutations d' adaptation ( Lerat et al. , 2000 ) . Figure 2 . Pathogenèse du VHC . 4.1 . L' évolution de la maladie et les symptômes cliniques L' hépatite C est une maladie progressive , la phase aiguë évolue vers une maladie chronique . A plus long terme , l' hépatite chronique peut causer une cirrhose et un hépatocarcinome ( Figure 2 ) . Plusieurs études ont montré que l' évolution chronique de cette maladie est fortement influencée par de nombreux facteurs , comme l' âge , le sexe , la consommation d' alcool ou la co-infection avec le virus de l' hépatite B ou avec celui de l' immunodéficience humaine ( VIH ) ( Lemon , 2007 ) . Par ailleurs , toute affection hépatique préexistante est aggravée par l' hépatite C. Ainsi , par exemple , le cancer hépatique progresse plus rapidement chez les individus atteints d' une hépatite alcoolique et également porteurs du VHC ( Lemon , 2007 ) . 4.1.1 . L' hépatite C aiguë Après contamination par le VHC , le patient va développer une hépatite aigüe qui est le plus souvent asymptomatique et rarement diagnostiquée . La période d' incubation , établie par des études réalisées avec des patients infectés par transfusions sanguines , varie entre 2 et 26 semaines , avec une moyenne de 7 semaines ( Lemon , 2007 ) . Bien que la plupart des cas soit asymptomatique , environ 20 % des patients développent des symptômes caractéristiques d' une hépatite virale aiguë , tels que la fatigue , des nausées , des douleurs , une urine noircie ou un ictère . Ce tableau clinique est associé à une élévation des transaminases hépatiques ( ASAT , ALAT ) , souvent supérieures à 10 fois les valeurs normales , suivie d' une séroconversion ( Lemon , 2007 ) . Des études indiquent que de 15 % à 30 % des cas d' hépatite aiguë guérissent spontanément . Les cas d' hépatites fulminantes sont extrêmement rares . La plupart des individus infectés ( de 70 % à 85 % ) développent une virémie persistante , presque toujours asymptomatique . L' évolution vers la chronicité n' est pas toujours associée à une élévation des transaminases hépatiques ou à des dommages du tissu hépatique ( Lemon , 2007 ) . 4.1.2 . L' hépatite C chronique Le passage de l' hépatite aigüe à une maladie chronique dépend d' un certain nombre de facteurs , comme par exemple l' âge et le sexe masculin . D' autres facteurs , viraux , génétiques ou immunitaires , pourraient également jouer un rôle important . L' infection chronique se caractérise par la persistance de la réplication virale avec une présence durable de l' ARN viral dans le sérum . De la même manière que l' hépatite aiguë , la forme chronique ne présente pas de symptômes spécifiques . Le plus souvent , l' individu manifeste une fatigue persistante et invalidante , mais les symptomes de la maladie hépatique n' apparaissent en général qu' après quelques décennies ( Lemon , 2007 ) . Malgré cela , la plupart des porteurs chroniques présentent des anomalies histologiques . Le stade de l' infection est normalement défini par une biopsie du foie , qui établit la gravité de l' atteinte du tissu hépatique , allant de l' inflammation vers la stéatose , la fibrose , puis la cirrhose , pour finir par le cancer . Les patients présentant une atteinte hépatique significative peuvent développer des complications graves . Néanmoins , le pronostic est difficile à prédire . L' hépatocarcinome , par exemple , est une complication tardive , apparaissant souvent à l' issue d' une cirrhose et se produisant typiquement après deux ou trois décennies d' infection persistante ( Lemon , 2007 ) ) . L' OMS estime qu' entre 10 et 20 % des porteurs chroniques développent une cirrhose , qui évolue en carcinome hépatocellulaire avec un taux de 5 % de cas par an ( OMS 2000 ) . Des évidences épidémiologiques fortes associent l' infection par le VHC au développement d' un hépatocarcinome . Néanmoins , comme tous les virus à ARN , le VHC se réplique exclusivement dans le cytoplasme , n' ayant aucun potentiel d' intégration du génome viral dans l' ADN cellulaire ( Lemon , 2007 ) . Ceci suggère que des méchanismes indirects contribuent au développement du cancer , incluant probablement l' état de cirrhose et d' inflammation prolongée , associés à un stress oxydatif avec un potentiel de dommage à l' ADN ( Okuda et al. , 2002 ) . De plus , il a été montré que certaines protéines du VHC pourraient être oncogènes . Par exemple , des souris transgéniques exprimant le gène de la capside du VHC développent non seulement une stéatose , mais également un cancer hépatique ( Moriya et al. , 1998 ; Moriya et al. , 2001 ) . Cette protéine semble d' ailleurs moduler l' action régulatrice de transcription de la protéine p 53 ( Kao et al. , 2004 ; Otsuka et al. , 2000 ) . D' autres protéines virales , notamment les protéines non structurales , pourraient être oncogènes ( Lerat et al. , 2002 ) . Il a été en effet montré que NS3 , NS5A et NS5B affectent la prolifération cellulaire ( Lemon , 2007 ) . 4.1.3 . Les manifestations extra-hépatiques Le VHC a été associé à plusieurs symptômes extrahépatiques , souvent d' origine immunologique ( pour revue ( Galossi et al. , 2007 ) . La cryoglobulinémie est la principale , présente chez 36 à 54 % des patients chroniques selon l' étude . Cette maladie est caractérisée par la présence de cryoglobulines , des immunoglobulines ( Ig ) anormales qui précipitent lors d' une exposition au froid . Elle est parfois associée à des problèmes rénaux ( glomérulonéphrites ) , cutanés ( purpura - lésion hémorragique au niveau de la peau ou des muqueuses ) , articulaires , ainsi qu' à certaines manifestations neurologiques ( pour revue ( Lemon , 2007 ; Saadoun et al. , 2007 ; Sansonno et al. , 2007 ) . Par ailleurs , le traitement de base contre le VHC , l' interféron- ? ( IFN- ? ) , est potentiellement inducteur d' auto-immunité et peut aggraver certaines pathologies . Néanmoins , le nombre réduit d' individus infectés développant des manifestations auto-immunitaires , suggère que l' auto-immunité serait restreinte à un sous-groupe de patients prédisposés ( Guadalupe Ercilla and Vinas , 2000 ) . 4.2 . La réponse immunologique de l' hôte et la persistance virale La qualité de la réponse immunitaire est essentielle pour l' élimination ou la persistance de l' infection par le VHC ( Figure 3 ) . L' élimination des antigènes viraux exige l' activation des réponses immunitaires humorale ( les lymphocytes B ) et cellulaire ( les lymphocytes T ) . Les lymphocytes T auxiliaires ( Th ) CD 4 + jouent un rôle important dans les fonctions immunorégulatrices à travers la modulation de la différentiacion des lymphocytes B et de l' activation des lymphocytes T cytotoxiques CD 8 + . Certains groupes de cellules Th CD 4 + , qui produisent de l' IFN- ? , participent à la défense contre les parasites intracellulaires , comme les virus , et stimulent l' action de cellules T cytotoxiques CD 8 + . Ces dernières détruisent les cellules infectées par des virus . Jusqu'à présent , les déterminants de l' immunité contre le VHC démeurent inconnus , néanmoins les études sur des chimpanzés et des humains présentant une guérison spontanée ont montré que la clairance virale est associée à une réponse T CD 8 + forte et durable , ciblant plusieurs épitopes du VHC ( Bowen and Walker , 2005 ; Racanelli and Manigold , 2007 ) . La reconnaissance des épitopes par les complexes majeurs d' histocompatibilité , les MHC-I et II , a permis leur identification . Les plus fréquents sont présents dans les protéines de capside et les protéines non structurales ( Day et al. , 2002 ; Gerlach et al. , 2005 ; Penna et al. , 2002 ; Schirren et al. , 2000 ; Schulze zur Wiesch et al. , 2005 ) . Néanmoins , il n' est pas encore établi si cette reconnaissance est liée à une présentation préferentielle par les cellules présentatrices d' antigènes de ces protéines , par rapport aux protéines d' enveloppe qui sont plus variables ( Lemon , 2007 ) . La clairance du VHC est également associée à une réponse T CD 4 + élevée . En effet , les individus séropositifs sains présentent des réponses plus fortes que celles des patients avec une hépatite chronique . Inversement , l' hépatite chronique est associée à des réponses T CD 4 + faibles ( Figure 3 ) ( Botarelli et al. , 1993 ; Valiante et al. , 2000 ) . Néanmoins , une réponse forte ne signifie pas forcément l' élimination du virus . De plus , les individus et les chimpanzés qui ont guéri , présentent un grand nombre de cellules de mémoire T CD 4 + et CD 8 + ( Bassett et al. , 2001 ; Day et al. , 2002 ; Day et al. , 2003 ; Lauer et al. , 2004 ; Major et al. , 2002 ; Shoukry et al. , 2003 ; Shoukry et al. , 2004 ; Takaki et al. , 2000 ) . D' un autre côté , les individus et les chimpanzés qui présentent une absence de cellules T spécifiques du virus possèdent un plus grand risque de développer une maladie chronique ( Cooper et al. , 1999 ; Gerlach et al. , 1999 ; Gruner et al. , 2000 ; Lauer et al. , 2002 ; Thimme et al. , 2002 ; Thimme et al. , 2001 ) . La plupart des individus infectés par le VHC développent des réponses T CD 4 + et T CD 8 + pendant la phase aiguë de la maladie , mais elles sont anormalement lentes , même lorsqu' il y a guérison spontanée ( Figure 3 ) ( Lemon , 2007 ) . Dans ce sens , il a été montré que durant l' infection primaire de chimpanzés , les cellules T CD 8 + spécifiques contre le VHC apparaissent relativement tard , elles sont détectables de 5 à 10 semaines après l' infection ( Cooper et al. , 1999 ; Lechner et al. , 2000 ; Shoukry et al. , 2003 ; Thimme et al. , 2002 ; Urbani et al. , 2005 ) . Ce qui suggère que les antigènes du VHC ne sont pas accessibles au système immunitaire et ne sont pas présentés aux cellules T pendant presque deux mois . Le système immunitaire pourrait ne pas « sentir » les virus jusqu'à ce que l' infection soit relativement avancée ( Racanelli and Manigold , 2007 ; Racanelli and Rehermann , 2003 ) . Figure 3 . Représentation schématique de la réponse immunitaire cellulaire au cours de l' infection aiguë par le VHC . ( d' après Bowen & Walker , Nature 205 ) A ) La virémie ( en rouge ) est présente rapidement et , bien qu' elle diminue après le pic , n' est jamais contrôlée . Il s' ensuit l' établissement d' une infection chronique avec une virémie variable chez les différents patients . Dans ces conditions , les réponses CD 4 + et CD 8 + ( en noir et en vert , respectivement ) ainsi que le niveau des transaminases sériques ( en bleu ) évoluent peu et peuvent être faibles voire absentes . B ) La virémie persiste pendant plusieurs semaines en absence de réponse immunitaire cellulaire détectable . L' apparition des réponses CD 4 + et CD 8 + est associée à un contrôle temporaire de la virémie ainsi qu' à des variations du niveau des transaminases sériques . Toutefois , après la chute de la réponse CD 4 + , la virémie réapparaît et devient persistante . Une réponse CD 8 + peut rester détectable malgré l' infection chronique . C ) Bien que la virémie apparaisse rapidement et que les réponses cellulaires apparaissent tardivement , le virus devient indétectable dans le plasma après l' apparition des cellules CD 4 + et CD 8 + qui coïncide souvent avec un niveau de transaminases sériques variable . Un rebond de la virémie peut avoir lieu avant la clairance virale . Les lymphocytes T CD 8 + sont , par ailleurs , spécialement présents dans le foie des porteurs chroniques ( Figure 3 ) ( Erickson et al. , 1993 ; Erickson et al. , 2001 ; Grabowska et al. , 2001 ; He et al. , 1999 ; Koziel et al. , 1993 ; Koziel et al. , 1992 ; Nelson et al. , 1998 ; Spangenberg et al. , 2005 ; Wong et al. , 1998 ; Wong et al. , 2001 ) . Cependant , ils ne sont probablement pas complètement fonctionnels ( Appay et al. , 2002 ; Gruener et al. , 2001 ; Lucas et al. , 2004 ; Wedemeyer et al. , 2002 ) . De plus , il a été montré que la protéine de capside possède un rôle suppresseur immunitaire sur la prolifération des cellules T et probablement sur leur différentiation ( Accapezzato et al. , 2004 ; Hahn , 2003 ) . L' expression de la capside pourrait également augmenter la résistance des hépatocytes à la cytolyse médiée par les cellules T , le principal mécanisme de mort cellulaire dans le foie ( Disson et al. , 2004 ; Kamegaya et al. , 2005 ; Yin and Ding , 2003 ) . La persistance de l' infection par le VHC a également été associée à une altération de l' activité des cellules Natural Killer ( NK ) . En effet , chez les patients présentant une maladie chronique les niveaux d' expression de récepteurs des cellules NK sont réduits . Inversement , chez les patients qui ont réussi à éliminer le virus par la thérapie antivirale , les niveaux d' expression étaient comparables à ceux observés chez les individus sains ( Nattermann et al. , 2006 ) . De plus , il a été montré qu' en interagissant avec la protéine CD81 , la protéine d' enveloppe E2 du VHC est capable de bloquer l' activation des cellules NK et d' inhiber la production d' IFN- ? par ces cellules ( Crotta et al. , 2002 ; Tseng and Klimpel , 2002 ) . Toutefois , la persistance de l' infection n' a pas encore été corrélée à une activité cytotoxique défectueuse ou à une production d' IFN- ? déficiente par ces cellules ( Golden-Mason and Rosen , 2006 ; Koziel , 2006 ) . Pour que les lymphocytes T puissent reconnaître et répondre spécifiquement à un antigène ils doivent être stimulés par d' autres cellules , les cellules présentatrices d' antigènes , telles que les cellules dendritiques et les phagocytes mononucléaires . Bien que les cellules dendritiques soient permissives à l' infection par plusieurs virus , leur capacité à supporter la réplication du génome viral est souvent inférieure à celle d' autres types cellulaires . Ceci suggère que l' importance de l' infection de ces cellules par les virus est plutôt de cibler les fonctions de présentation d' antigènes que de produire de nouveaux virus ( Pachiadakis et al. , 2005 ) . En ce qui concerne le VHC , il a été montré que des patients peuvent présenter des monocytes et des PBMC infectés ( Lerat et al. , 1998 ; Muratori et al. , 1996 ) . Certaines études ont détecté le génome du VHC dans des cellules dendritiques , dérivées de monocytes isolés à partir du sang périphérique de patients infectés ( Bain et al. , 2001 ; Navas et al. , 2002 ) . D' autres ont montré que les porteurs chroniques possèdent un nombre réduit de cellules dendritiques , qui parfois présentent des déficiences fonctionnelles , pouvant causer une mauvaise présentation d' antigènes aux cellules T ( Golden-Mason and Rosen , 2006 ; Pachiadakis et al. , 2005 ) . Les lymphocytes B , les cellules productrices d' anticorps , peuvent également être stimulés directement par des antigènes viraux . D' ailleurs , la cryoglobulinémie associée au VHC peut évoluer vers un lymphome Non-Hodgkinien de cellules B. D' autre part , l' infection par le VHC entraîne la production d' anticorps dirigés contre les protéines virales chez la majorité des patients chroniquement infectés . Des anticorps neutralisants ont d' ailleurs été détectés dans les sérums de patients infectés , les principales cibles étant la protéine d' enveloppe E2 présente à la surface de la particule virale ( Bartosch et al. , 2003a ; Farci et al. , 1994 ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005a ; Logvinoff et al. , 2004 ; Meunier et al. , 2005 ; Yu et al. , 2004 ) . Des anticorps dirigés contre la région hypervariable 1 ( HVR1 ) de E2 ont montré , par exemple , une activité neutralisante in vitro et in vivo ( Farci et al. , 1996 ; Shimizu et al. , 1996 ) . De plus , différentes études suggèrent que chez les patients qui éliminent le virus , la clairance virale est associée à l' induction rapide de la production d' anticorps neutralisants dans la phase précoce de l' infection et/ou à une réduction de la diversification de l' épitope HVR1 ( Lavillette et al. , 2005a ; Mondelli et al. , 2003 ; Pestka et al. , 2007 ) . Par contre , le rôle des anticorps neutralisants dans le contrôle de l' infection est remis en question par le fait que la réinfection est possible en leur présence et qu' ils sont également détectés dans les sérums de patients chroniquement infectés ( Farci et al. , 1992 ; Lemon , 2007 ) . Le VHC est également capable de moduler les défenses anti-virales des cellules infectées , c' est à dire les voies de signalisation cellulaires qui mènent à la synthèse d' interférons de type 1 et à d' autres gènes stimulés par l' interféron ( ISG ) , qui ont un potentiel antiviral . Il semblerait que les protéines du VHC , particulièrement NS3 / 4A , bloquent ces voies de signalisation ( Foy et al. , 2003 ; Gale and Foy , 2005 ; Loo et al. , 2006 ) . En effet , la protéase virale NS3 / 4A bloque les voies de signalisation normalement activées par la présence d' ARN double brin dans le cytoplasme , car elle clive des protéines cellulaires nécessaires à la transduction de signal ( Lemon , 2007 ) . Par contre , il n' est pas encore bien établi si cette évasion des voies de signalisation de l' interféron contribue à l' établissement d' une infection persistante ( Gale and Foy , 2005 ) . D' autres études suggèrent que les protéines de capside , E2 et NS5A , pourraient également moduler certaines voies de signalisation ( Gale et al. , 1997 ; Heim et al. , 1999 ; Hosui et al. , 2003 ; Miller et al. , 2004 ; Pflugheber et al. , 2002 ) . Le réseau de ces interactions contribuerait à l' évasion des réponses antivirales cellulaires , en rendant le virus relativement résistant aux actions antivirales de l' IFN et à d' autres protéines activées par les ARN double brin ( Lemon , 2007 ) . En résumé , pendant la phase aiguë de l' infection , il a été proposé que les anticorps neutralisants , les cellules Th et les cellules cytotoxiques étaient critiques pour la clairance du VHC . Il est probable , que tous ces effecteurs de la réponse immunitaire jouent des rôles majeurs dans la résolution de la maladie . Par contre , pendant la phase chronique , la situation est différente parce que le virus s' est déjà établi dans l' hôte et continue à survivre aux attaques continues du système immunitaire . Les mécanismes d' échappement à la réponse immunitaire de l' hôte développés par le VHC démeurent méconnus ( Lemon , 2007 ) . Des modèles cellulaires indiquent que certaines protéines virales possèdent des rôles inhibiteurs et suppresseurs des cellules T régulatrices . En effet , la protéine d' enveloppe E2 présentant des variations dans la séquence HVR1 pourrait inhiber les réponses T CD 4 + spécifiques contre le virus ( Frasca et al. , 1999 ) . Par ailleurs , l' introduction de mutations aléatoires dans le génome viral induit l' émergence de variants d' échappement , lorsque elles ont lieu sur des épitopes soumis aux pressions de sélection du système immunitaire ( Lemon , 2007 ) . Ces mutations facilitent l' échappement à la reconnaissance de cellules infectées par les cellules T CD 8 + ( Bowen and Walker , 2005 ) . Pendant la phase chronique , le génome viral présente une diversification limitée , qui est probablement liée à une génération détériorée de cellules T CD 8 + ( Lemon , 2007 ) . Des mutations dans leurs épitopes MHC-I sont en effet sélectionnées pendant les infections chez l' homme et chez le chimpanzé ( Bowen and Walker , 2005 ; Cox et al. , 2005 ; Erickson et al. , 2001 ; Ray et al. , 2005 ; Tester et al. , 2005 ; Timm et al. , 2004 ) . Néanmoins , quelques populations de cellules T pourraient ne jamais atteindre le seuil nécessaire pour exercer une pression sélective significative ( Lemon , 2007 ) . D' autres hypothèses ont été proposées : un haut niveau de réplication du VHC pourrait causer l' épuisement du système immunitaire à travers la production de quantités énormes d' antigènes ; la suppression de l' expansion des cellules Th spécifiques du VHC ; l' induction de l' apoptose des cellules T CD 8 + spécifiques dirigées contre le virus ; et l' accumulation de mutations portées par les protéines d' enveloppe ( Lemon , 2007 ) . Une autre hypothèse en lien avec les protéines d' enveloppe est que leur niveau de glycosylation pourrait moduler l' immunogénicité des particules virales et ainsi restreindre l' accès des anticorps neutralisants à la surface des virions ( Helle et al. , 2007 ) . 5 . Les traitements L' importance du génotypage du VHC chez les patients chroniquement infectés vient du fait que , selon le génotype du virus , la durée et la réponse au traitement peuvent varier . Aujourd'hui , le traitement de référence est basé sur l' utilisation de l' IFN- ? pégylé associé à la ribavirine , un analogue nucléosidique de la guanosine ayant un effet antiviral sur de nombreux virus . La prévention de l' infection répose uniquement sur la réduction ou l' élimination des risques de transmission , car malheureusement il n' existe pas encore de vaccin contre l' hépatite C . La durée de la thérapie varie entre 6 et 12 mois selon le génotype viral . En général , les patients chroniquement infectés avec les génotypes 2 et 3 suivent un traitement pendant 6 mois avec une faible dose de ribavirine . Parmi ces patients , de 76 % à 82 % des individus présentent une réponse virologique prolongée , c' est-à-dire l' absence de détection de l' ARN viral dans le sérum six mois après la fin du traitement . En revanche , seulement 42 % à 46 % des patients infectés par le génotype 1 , traités pendant 12 mois avec une forte dose de ribavirine , possèdent une élimination permanente du virus ( Lemon , 2007 ; Poynard et al. , 2003 ) . En plus d' un taux élevé de non-répondeurs , ces traitements sont longs , coûteux et peuvent donner lieu à des effets secondaires non négligeables , tels qu' une neutropénie , une perte de poids , des nausées , un syndrome grippal ( fièvre , myalgies , frissons ) et un état dépressif . Sans compter qu' ils sont contre-indiqués dans un certain nombre de cas , comme la grossesse , l' insuffisance rénale sévère , l' hépatite auto-immune , entre autres ( Fried , 2002 ) . Pour cela , il est essentiel d' identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l' hépatite C . A l' heure actuelle , plusieurs molécules sont en phase clinique . Certaines d' entre elles visent à améliorer le traitement actuel . C' est le cas de l' Albuferon-alpha et de la Viramidine , qui sont en phase III . L' Albuferon-alpha corresponds à l' IFN fusionné à l' albumine , ce qui lui confère une demi-vie plus longue que l' IFN pégylé . La Viramidine est un précurseur de la ribavirine avec son effet anti-VHC , mais sans l' effet hémotylique induit par le traitement avec cette molécule . D' autres composants ciblent spécifiquement le virus , ce qui devrait rendre le traitement plus spécifique et moins toxique ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ; Pawlotsky et al. , 2007 ) . C' est en effet le cas de la molécule VX- 950 ( telaprevir ) , une molécule mimant la région carboxy-terminale ( C-terminale ) de NS3 et capable de bloquer cette protéase virale . Le telaprevir présente une activité importante dans le système de réplicons et il possède des effets antiviraux chez les patients infectés ( Forestier et al. , 2007 ; Reesink et al. , 2006 ) . De manière intéressante , la combinaison du telaprevir avec de l' IFN- ? et de la ribavirine induit un effet antiviral encore plus efficace ( Lawitz et al. , 2008 ) . Certains patients ont présenté le développement de variants de résistance à la molécule , mais ils démeurent sensibles au traitement avec l' IFN- ? et la ribavirine ( Lawitz et al. , 2008 ; Sarrazin et al. , 2007a ) . Plusieurs études ont donné des résultats encourageants quant à l' utilisation de vaccins comme traitement prophylactique contre le VHC . Un essai de vaccination a été réalisé chez le chimpanzé avec des hétérodimères des glycoprotéines virales E1E2 purifiés ( Ralston et al. , 1993 ) . Cet antigène permettait la production d' anticorps ainsi qu' une réponse immunitaire cellulaire de type Th dirigée contre les protéines d' enveloppe E1 et E2 ( Choo et al. , 1994 ) . Plusieurs approches de vaccination sont en essai clinique pour une utilisation en complément aux traitement existants ( Houghton and Abrignani , 2005 ) . Des données préliminaires suggèrent que la réponse au traitement IFN / ribavirine est étroitement liée à la réponse immunitaire cellulaire ( Cramp et al. , 2000 ; Nelson et al. , 1998 ; Vrolijk et al. , 2003 ) et à la réponse immunitaire humorale , avec des anticorps probablement dirigés contre les protéines d' enveloppe ( Baumert et al. , 2000 ) . Il semble donc possible d' amplifier la réponse immunitaire par une vaccination appropriée afin d' améliorer le taux de réponse de la thérapie standard . L' utilisation d' un antigène E1 en présence d' un adjuvant à base d' alun permet par exemple d' amplifier les réponses immunitaires humorale et cellulaire dirigées contre E1 chez les patients virémiques ( Nevens et al. , 2003 ) . En outre , l' anticorps monoclonal humain de haute affinité XTL- 002 dirigé contre la glycoprotéine E2 du VHC réduit de manière dose-dépendante les niveaux de VHC sériques dans le système de souris « VHC-Trimera » ( Ilan et al. , 2002 ) . Chez les patients qui ont reçu une dose intraveineuse de cet anticorps , la charge virale a également été réduite ( Bayes et al. , 2004 ) . II . Le virus de l' Hépatite C ( VHC ) 1 . La classification et la variabilité génomique Le génome du VHC présente des caractéristiques communes à d' autres virus à ARN simple brin de polarité positive . L' analyse des séquences clonées a montré des similitudes avec les virus appartenant aux genres Flavivirus ( comme les virus de la Fièvre Jaune et de la Dengue ) et Pestivirus ( comme le virus de la Diarrhée Bovine ) , tous appartenant à la famille des Flaviviridae ( Miller and Purcell , 1990 ) ( Figure 4 ) . Des analyses ultérieures ont permis la classification du VHC dans un genre séparé , l' Hepacivirus ( Houghton , 1996 ) . Un autre groupe de virus qui appartient à cette famille comprend les agents GB , nommés GBV-A , - B et -C ( Karayiannis and McGarvey , 1995 ) . Le GBV-B est un virus hépatotrope qui présente une forte identité de séquence avec le VHC ( Ferron et al. , 2005 ) . Figure 4 . Arbre phylogénétique de la famille des Flaviviridae . ( d' après Ferron et al. , BMC Informatics 2005 ) La présence du VHC chez les populations humaines a produit un grand nombre de variants ou génotypes distincts , numérotés de 1 à 6 . Chaque génotype possède plusieurs sous-types qui sont désignés par des lettres ( Simmonds et al. , 1993 ) ( Figure 5 ) . Les génotypes diffèrent entre eux de 31 % à 33 % au niveau de leurs séquences nucléotidiques . La variation est de 20 % entre les sous-types et d' un peu moins de 10 % dans chaque sous-type ( Pawlotsky , 2003 ; Simmonds , 1995 ; Simmonds , 2004 ) . Figure 5 . Arbre phylogénétique réalisé à partir des séquences codantes complètes des différents génotypes du VHC . ( d' après la base de données sur le VHC de Los Alamos , Etats-Unis ) 1.1 . L' émergence et la diversification des génotypes Cette variabilité génomique est le résultat de l' accumulation de mutations dans le génome pendant le processus de réplication virale . Le VHC , comme les autres virus à ARN , réplique son matériel génétique en utilisant une ARN polymérase ARN-dépendante . Cette enzyme introduit des erreurs au hazard lors de la réplication et , à l' inverse de l' ADN polymérase , elle ne possède pas la capacité de correction de ses erreurs de lecture . En effet , la fréquence d' erreurs de l' ARN polymérase ARN-dépendante du VHC est de l' ordre de 10 - 4 à 10 - 5 par position nucléotidique ( Domingo et al. , 2006 ; Pawlotsky , 2003 ) . Ce qui permet une sélection naturelle rapide des virions adaptés aux nouveaux environnements chez les différents hôtes . Comme la production de particules virales par les cellules infectées est très importante , environ 1012 virions par jour ( Neumann et al. , 1998 ) , les erreurs de réplication s' accumulent et génèrent une diversité génétique au sein de chaque individu infecté , ce qui conduit à l' apparition de quasi-espèces . Tandis que des mutations resteraient silencieuses par la conservation des mêmes acides aminés , certaines conduiraient à la synthèse de génomes défectifs , produisant des virions non viables . D' autres enfin conféreraient un avantage ou un handicap sélectif selon l' environnement dans lequel le virus évolue . L' accumulation de mutations pourrait aboutir à des changements de la biologie virale pouvant conduire par exemple à l' augmentation de la sensibilité à la réponse immunitaire ou à l' emergence de virions plus résistants . 1.2 . La distribution mondiale des génotypes Les génotypes du VHC se répartissent d' une façon variée entre les différentes régions géographiques du monde ( Figure 6 ) . Par exemple , l' Europe et l' Amérique du Nord présentent plusieurs génotypes avec une nombre restreint de sous-types . Dans ces pays , les sous-types 1a , 1b , 2a , 2b et 3a sont les plus fréquents et l' existence d' autres génotypes serait due aux immigrations ou voyages récents dans des pays lointains ( Smith and Simmonds , 1997 ) . D' autres régions sont caractérisées par l' existence de plusieurs sous-types d' un seul génotype prédominant . Cela est observé en Guinée pour le génotype 1 ; dans certaines régions de l' Afrique Centrale et de l' Est pour le génotype 2 ; en Inde pour le génotype 3 ; en Afrique Centrale pour le génotype 4 ; et en Asie du Sud-est pour le génotype 6 . Une région endémique pour le génotype 5 n' a pas encore été identifiée , mais il est possible qu' elle soit l' Afrique du Sud , parce que c' est le seul endroit où ce génotype est très commun ( Smith et al. , 1997 ) . Figure 6 . Distribution géographique des différents génotypes du VHC . ( d' après Zein , Clin . Microbiol . Rev . 2000 ) L' origine de la variation génotypique du VHC est incertaine . Ces variants pourraient être récents , issus d' une dissémination epidémique au travers de nouvelles voies de transmission au sein de la population humaine en croissance ; ou alors , ils pourraient être beaucoup plus anciens , résultant d' une présence continue du virus dans une population isolée . Des études ont identifié le taux de substitution par site nucléotidique et par an , indiquant qu' un ancêtre commun à tous les génotypes aurait existé il y a environ 500 ans ( Smith et al. , 1997 ) . Néanmoins , tandis que quelques génotypes sont ubiquitaires , d' autres sont isolés dans des régions géographiques particulières , où une extrême diversité de sous-types existe . Cette distribution est plutôt une conséquence d' une longue période d' infection endémique , pendant laquelle il n' y a pas eu d' échange avec les génotypes d' autres régions . La transmission virale s' est produite continuellement par des voies parentérales issues des pratiques culturelles spécifiques et/ou par des voies verticales , sexuelles et familiales . Le temps de divergence des génotypes du VHC pourrait alors précéder considérablement les voies modernes de transmission parentérale ( Smith et al. , 1997 ) . Ainsi , la grande diversité de sous-types d' un seul génotype dans une population donné signale que l' infection est endémique depuis une longue période de temps , pouvant aller de 500 à 2000 ans . Inversement , la grande dissémination d' un génotype avec peu de variété de sous-types , comme le 1b en Europe , met en évidence l' introduction relativement récente de ce variant ( Mellor et al. , 1995 ; Smith et al. , 1997 ) . Par ailleurs , le fait que les génotypes 1b , 2a et 2b soient présents dans presque toutes les régions du monde pourrait être liée à des interventions médicales , telles que le vaccin contre la fièvre jaune contenant du sérum humain , l' utilisation de seringues non-stérilisées et ré-utilisées pour les injections , la vaccination contre la variole , etc ( Smith et al. , 1997 ) . 1.3 . Les génotypes et la pathogenèse de la maladie Le rôle des génotypes du VHC dans la progression de la maladie est particulièrement controversé ( Zein , 2000 ) . Certaines études suggèrent que le génotype 1b pourrait être associé à une atteinte hépatique plus sévère et à une évolution plus aggressive de la maladie que les autres génotypes . Par contre , d' autres études réfutent ces associations . D' une manière générale , le génotype viral ne semble pas influencer le taux de passage à la chronicité , la sévérité des lésions hépatiques ou le développement de manifestations extra-hépatiques . Cependant , la stéatose hépatocytaire est induite directement par le VHC de génotype 3 , suggérant que certaines séquences virales induisent l' accumulation intracellulaire de lipides ( Hui et al. , 2002 ; Rubbia-Brandt et al. , 2004 ; Rubbia-Brandt et al. , 2001 ; Rubbia-Brandt et al. , 2000 ; Westin et al. , 2002 ) . Au cours des infections causées par d' autres génotypes , la stéatose semble être principalement métabolique ( Bjornsson and Angulo , 2007 ; Negro , 2006 ) . Ce dommage tissulaire est marqué par l' accumulation de gouttelettes lipidiques ( GL ) de plusieurs tailles dans le cytoplasme cellulaire ( Moriya et al. , 1997 ) . La protéine de capside , principalement de génotype 3 , semble jouer un rôle dans le développement de la stéatose ( Barba et al. , 1997 ; Boulant et al. , 2006 ; Hope and McLauchlan , 2000 ; Rubbia-Brandt et al. , 2000 ) et elle se retrouve à la surface de ces GL ( Hope et al. , 2002 ; Rouille et al. , 2006 ) . Il a été montré que son expression dans les cellules hépatocytaires induit la présence de GL présentant un volume significativement plus grand ( Piodi et al. , 2008 ) . Cette étude a également montré que ces grandes GL sont présentes en plus grand nombre dans les cellules exprimant la protéine de capside de génotype 3a . Toutefois , Piodi et collaborateurs n' ont pas observé de différences significatives entre les séquences issues de patients infectés par le VHC de ce génotype et présentant ou non une stéatose . Ceci suggère que d' autres protéines virales pourraient agir directement ou moduler la fonction de la protéine de capside , ou alors que des facteurs de l' hôte déterminaraient si la réplication du VHC de génotype 3a déclenche la formation et la croissance des GL ( Piodi et al. , 2008 ) . 2 . Les propriétés biophysiques de la particule virale Le VHC est un virus enveloppé sphérique de 55 à 65 nm de diamètre ( Kaito et al. , 1994 ) . Il est constitué d' une nucléocapside d' environ 30 nm de diamètre et d' une enveloppe lipidique dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 ( Figure 7A ) . De nombreuses études ont permis de déterminer que le VHC circule sous différentes formes dans le sang des patients infectés . Ces diverses formes présentent une distribution hétérogène dans un gradient de densité . La plupart des sérums analysés présentent deux populations majeures , les particules de faible ( 1 , 03 & 226;& 128;& 147; 1 , 08 g / mL ) et de haute densité ( 1 , 17 & 226;& 128;& 147; 1 , 25 g / mL ) ( Andre et al. , 2002 ; Prince et al. , 1996 ) . Les particules de haute densité sont associées à des Ig et sont peu infectieuses ( Choo et al. , 1995 ; Hijikata et al. , 1993 ; Maillard et al. , 2001 ) . D' un autre côté , celles de faible densité résultent de l' association avec des lipoprotéines de très faible ou de faible densité ( VLDL et LDL ) ( Andre et al. , 2002 ; Monazahian et al. , 2000 ; Nielsen et al. , 2006 ) . Il semblerait que les particules les plus infectieuses aient une densité comprise entre 1 , 09 et 1 , 11 g / mL ( Bradley et al. , 1991 ; Hijikata et al. , 1993 ) . Une étude récente a montré que la production virale par les hépatocytes était dépendante de l' assemblage et de la sécrétion des VLDL , suggèrant que les particules du VHC seraient liées ou incorporées aux VLDL durant leur assemblage et seraient ensuite sécrétées avec ces lipoprotéines ( Huang et al. , 2007 ) . Dans ce sens , il a été montré que les particules du VHC sont assemblées dans un compartiment intracellulaire sous forme de particules de forte densité ( > 1 , 15g / mL ) , mais qu' elles acquièrent des éléments qui leur confèrent une faible densité ( < 1 , 14g / mL ) durant leur sécrétion ( Gastaminza et al. , 2006 ) . Enfin , une autre étude a décrit une forme de virions de faible densité , nommée lipo-viro-particule ( Andre et al. , 2002 ) . Ces particules sont riches en triglycérides et contiennent au moins les apolipoprotéines B et E , l' ARN du VHC et la protéine virale de capside . Elles sont également associées à des IgG et IgM . Figure 7 . A ) Représentation schématique d' une particule du VHC . B ) Organisation génomique du VHC . Des études sur l' inactivation des particules virales ont été réalisées au début des années 80 , à l' époque où l' hépatite C était encore appelée hépatite non-A non-B. Ces études ont montré que l' agent des hépatites non-A non-B était inactivé par des traitements au chloroforme ( Feinstone et al. , 1983 ) , à la formaline au 1 / 1000 ( Yoshizawa et al. , 1982 ) , par irradiation avec des rayons ultra-violet ( Prince et al. , 1985 ) et par chauffage à 100 °C pendant 1 heure ( Yoshizawa et al. , 1982 ) ou à 60 °C pendant 10 heures ( Hollinger et al. , 1984 ) . Néanmoins , des études plus approfondies seraient nécessaires pour confirmer les conditions capables d' inactiver ce virus . 3 . L' organisation du génome Le génome du VHC est constitué d' un ARN simple brin de polarité positive de 9 , 6 kb environ ( Choo et al. , 1989 ) avec un cadre ouvert de lecture ( ORF ) , encadré par deux extrémités non-codantes ( 5 ' NC et 3 ' NC ) . L' ORF code une polyprotéine d' environ 3000 acides aminés ( Reed and Rice , 2000 ) ( Figure 7B ) . 3.1 . Les extrémités non codantes 3.1.1 . La région 5 ' non codante La région 5 ' non codante ( 5 ' NC ) , importante pour la réplication du génome viral et la traduction des protéines virales , est très conservée parmi les différents isolats du VHC ( Honda et al. , 1999 ) . Ce segment génomique est essentiel à la traduction de la polyprotéine et à la réplication du génome . Elle est constituée de 341 nucléotides et comporte quatre domaines distincts , de I à IV ( Figure 7B ) . Des signaux critiques pour la réplication du génome sont localisés dans les domaines I et II ( nucléotides 1 à 115 ) , mais la séquence entière de la région 5 ' NC est nécessaire à une réplication efficace de l' ARN ( Friebe et al. , 2001 ; Kim et al. , 2002 ) . Les domaines II à IV ( nucléotides 44 à 341 ) ainsi que le début de la séquence de l' ORF contiennent un site interne d' entrée des ribosomes ( IRES ) . L' IRES est capable de se lier à la sous-unité ribosomal 40S avec une grande affinité et en absence des facteurs de transcription canoniques , d' une manière similaire aux ARN messagers procaryotes ( Honda et al. , 1996 ; Pestova et al. , 1998 ) . Cette sous-unité ribosomale , associée au facteur de transcription eIF 3 , se fixe sur la partie basale du domaine III rapprochant ainsi le complexe d' initiation du codon AUG d' initiation qui se trouve au sein du domaine IV ( Sarnow , 2003 ; Siridechadilok et al. , 2005 ) . La région 5 ' NC est une bonne cible pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques . Des études d' inhibition de la traduction par des ARN interférents dirigés contre cette région ont en effet été publiées ces dernières années ( Kanda et al. , 2007 ; Prabhu et al. , 2006 ; Ray and Das , 2004 ) . Par ailleurs , Jopling et collaborateurs ont montré qu' un micro-ARN ( miR- 122 ) , spécifiquement exprimé dans les hépatocytes humains , facilite la réplication de l' ARN viral en interagissant avec la région 5 ' NC du génome viral ( Jopling et al. , 2005 ) . 3.1.2 . La région 3 ' non codante La région 3 ' non codante ( 3 ' NC ) , de taille variable ( environ 250 nucléotides ) , présente trois régions distinctes : une séquence peu conservée de 40 à 50 nucléotides ; une zone poly-uracile / pyrimidine ( poly ( U / UC ) ) de longueur variable ; et une séquence très conservée de 98 nucléotides . Celle  -ci joue un rôle important dans l' initiation de la synthèse du brin d' ARN négatif au cours de la réplication ( Kolykhalov et al. , 1996 ) . La stabilité de la structure de la région 3 ' NC semble être importante pour la réplication virale ( Friebe and Bartenschlager , 2002 ) . D' autre part , cette région pourrait favoriser la traduction du génome viral ( Murakami et al. , 2001 ; Song et al. , 2006 ) . En effet , il semblerait que la région 3 ' NC est capable de stimuler l' acitivité de l' IRES du VHC , augmentant la traduction du génome viral . 3.2 . Les protéines virales Figure 8 . Les protéines du VHC et leur association avec la membrane du RE. ( d' après Moradpour et al. Nature Reviews Microbiology 2007 ) Le génome du VHC présente un ORF codant une polyprotéine d' environ 3000 acides aminés , qui est synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique ( RE ) et subit différents clivages co- et post-traductionnels ( Figures 7B et 8 ) . Les clivages C / E 1 , E1 / E2 , E 2 / p 7 , et p 7 / NS2 sont assurés par des peptidases signal d' origine cellulaire ( Dubuisson et al. , 2002 ) . Le reste de la polyprotéine est clivé par deux protéases virales , NS2 et NS3 / 4A. Ainsi , la traduction de l' ORF aboutit à la formation d' au moins dix protéines matures : C , E1 , E2 , p 7 , NS2 , NS3 , NS4A , NS4B , NS5A et NS5B ( Figures 7B et 8 ) . Les protéines C , E1 et E2 sont dites « structurales » car elles sont associées aux virions , tandis que les protéines NS ( « non-structurales » ) joueraient un rôle dans le cycle viral . De plus , il a été décrit qu' un cadre de lecture alternatif chevauchant le début de la séquence de la protéine C code une onzième protéine , la protéine F . 3.2.1 . La protéine C La protéine de capside ou protéine C est l' élément protéique de la nucléocapside virale . Elle est très conservée et fortement antigénique ( Houghton et al. , 1991 ) . Cette protéine peut exister sous différentes formes . D' abord , un clivage à son extrémité C-terminale donne naissance à une forme « immature » , de 23 kDa et formée des 191 premiers acides aminés de la polyprotéine précurseur ( Santolini et al. , 1994 ) . Ensuite , l' action d' une peptidase de peptide signal ( SPP ) conduit à la forme dite « mature » d' environ 21 kDa ( McLauchlan , 2000 ; McLauchlan et al. , 2002 ) . Au sein de la protéine de capside , trois domaines fonctionnels ont été décrits ( Hope and McLauchlan , 2000 ) . Le domaine 1 ( acides aminés 1 à 118 ) constitue une région de liaison avec la région 5 ' NC du génome , permettant la formation de la nucléocapside . Le domaine 2 ( acides aminés 119 à 174 ) assure la maturation et la mise en conformation du domaine 1 ( Boulant et al. , 2005 ) , mais il est aussi important pour conférer les propriétés membranaires de la protéine . En effet , la capside est retrouvée au niveau des membranes , telles que celles du RE ( Figure 8 ) , mais elle est localisée majoritairement dans un compartiment associé aux GL des cellules infectées ( Rouille et al. , 2006 ) . Il a été d' ailleurs suggéré que l' interaction avec les GL pourrait affecter le métabolisme des lipides et contribuer au développement de la stéatose hépatique , surtout chez les patients infectés par le VHC de génotype 3 ( Asselah et al. , 2006 ) . Enfin , le domaine 3 ( acides aminés 175 à 191 ) sert de peptide signal pour le clivage entre C et E1 et pour l' adressage de E1 dans la lumière du RE ( Santolini et al. , 1994 ) . La protéine de capside pourrait intervenir dans la régulation de l' expression de certains gènes cellulaires ( Jackel-Cram et al. , 2007 ; Nguyen et al. , 2006 ; Sillanpaa et al. , 2008 ; Watashi and Shimotohno , 2003 ) , dans l' apoptose ( pour revue ( Fischer et al. , 2007 ) ) , dans la prolifération cellulaire ( Jin et al. , 2005 ; Sato et al. , 2006 ) et pourrait interférer avec le métabolisme lipidique ( Jarmay et al. , 2005 ; Jhaveri et al. , 2008 ; Kim et al. , 2007 ) . Cependant , certaines de ces fonctions sont encore controversées . 3.2.2 . La protéine F Parallèlement à la traduction de l' ORF , une petite protéine nommée protéine F ou ARFP ( protéine issue d' un cadre alternatif de lecture ) ( Branch et al. , 2005 ; Lo et al. , 1995 ; Lo et al. , 1994 ) est synthétisée . Son gène chevauche en partie celui de la protéine de capside . Des études dans des systèmes de réticulocytes de lapin indiquent que cette protéine est produite par un décalage du cadre de lecture - 2 / + 1 au niveau d' une séquence de glissement , les codons 8 - 11 de la séquence codant la protéine de capside ( Varaklioti et al. , 2002 ; Xu et al. , 2001 ) . D' autres études réalisées en culture cellulaire indiquent que des sites internes d' initiation de traduction existent dans les positions 26 et 85 - 87 de la séquence codant la protéine de capside ( Baril and Brakier-Gingras , 2005 ; Vassilaki et al. , 2008 ; Vassilaki and Mavromara , 2003 ) . La protéine F possède une taille variable en fonction du génotype étudié , mais ne dépasse pas 160 acides aminés ( Boulant et al. , 2003 ) . Sa localisation intracellulaire est périnucléaire ( Roussel et al. , 2003 ) , en association avec le RE ( Vassilaki et al. , 2008 ; Xu et al. , 2001 ) et sa demi-vie est estimée à dix minutes , car elle est dégradée par le protéasome ( Roussel et al. , 2003 ; Xu et al. , 2003 ) . Bien que sa fonction reste inconnue , son expression ne semble pas nécessaire à la réplication de l' ARN viral ( McMullan et al. , 2007 ) . Récemment , il a été suggéré que la protéine F jouerait un rôle transformant chez des patients infectés , via sa capacité à stimuler le proto-oncogène de c-myc ( Ma et al. , 2008 ) . De plus , il a été montré qu' elle pourrait avoir des fonctions immunomodulatrices ( Fiorucci et al. , 2007 ) . Certains patients présentent d' ailleurs des anticorps et une réponse immunitaire cellulaire anti-F ( Bain et al. , 2004 ; Komurian-Pradel et al. , 2004 ; Varaklioti et al. , 2002 ; Walewski et al. , 2001 ; Xu et al. , 2001 ) . 3.2.3 . Les protéines d' enveloppe E1 et E2 Un chapitre sur les protéines d' enveloppe du VHC est développé par la suite ( Cf partie III . 1 . ) . 3.2.4 . La protéine p 7 La protéine p 7 est constituée de 63 acides aminés ( 747 à 809 ) et se situe à la jonction entre les protéines structurales et non structurales ( Lin et al. , 1994 ) . La comparaison des séquences de p 7 de différents génotypes montre une relative variabilité des acides aminés , cependant l' organisation globale et la nature des résidus demeurent constantes ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ) . La protéine p 7 possède deux domaines transmembranaires ( TMD ) , ancrés dans les membranes du RE ( Figure 8 ) et les extrémités N- et C-terminales sont dirigées vers la lumière du RE ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ) . Elle est également retrouvée au niveau des membranes mitochondriales ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ; Griffin et al. , 2005 ) . Des études indiquent que 7 aurait une activité de canal ionique au sein de membranes ( Griffin et al. , 2004 ; Pavlovic et al. , 2003 ; Premkumar et al. , 2004 ) , qu' elle est essentielle à l' infection du VHC chez les chimpanzés ( Sakai et al. , 2003 ) et qu' elle agit à une étape précoce de la morphogenèse des particules infectieuses ( Jones et al. , 2007 ) . Il a en effet été montré que la protéine p 7 est essentielle à l' assemblage et sécrétion efficace de virions infectieux ( Steinmann et al. , 2007 ) . 3.2.5 . La protéine NS2 La protéine NS2 ( acides aminés 810 à 1026 ) est une protéine transmembranaire non essentielle à la formation du complexe de réplication du VHC ( Blight et al. , 2000 ; Lohmann et al. , 1999 ) . Lorsque NS2 est exprimée seule , elle se retrouve associée aux membranes du RE ( Figure 8 ) ( Franck et al. , 2005 ) . NS2 forme avec le tiers amino-terminal ( N-terminal ) de NS3 une autoprotéase , qui assure le clivage entre NS2 et NS3 ( pour revue ( Lindenbach and Rice , 2005 ) ) . La structure du domaine catalytique de NS2 montre une protéase à cystéines , de forme dimérique , avec deux sites actifs ( Lorenz et al. , 2006 ) . Cette protéase nécessite une activation par la protéine chaperon cellulaire Hsp 90 ( Waxman et al. , 2001 ) . Bien que le rôle de NS2 ne soit pas connu , plusieurs fonctions lui ont été attribuées . Elle serait impliquée dans la phosphorylation de NS5A ( Liu et al. , 1999 ) et pourrait participer à la morphogenèse du VHC ( Jones et al. , 2007 ; Yi et al. , 2007 ) . Par ailleurs , des sites de recombinaison conduisant à la formation de virus infectieux chimériques intergénotypiques ont été cartographiés dans NS2 ( Legrand-Abravanel et al. , 2007 ; Lindenbach and Rice , 2005 ; Noppornpanth et al. , 2006 ; Pietschmann et al. , 2006 ) . 3.2.6 . Les protéines NS3 & 226;& 128;& 147; NS4A La protéine NS3 ( acides aminés 1027 à 1657 ) possède une double fonction enzymatique . Sa région N-terminale a une fonction sérine protéinase , alors que son extrémité C-terminale possède une activité hélicase et NTPase . La fonction sérine protéinase du tiers N-terminal de NS3 se rapproche de la famille des sérine protéinases de type chymotrypsine . Ce domaine de NS3 est associé au cofacteur NS4A ( acides aminés 1658 à 1711 ) , ce qui permet son stabilisation , car NS3 est dégradée rapidement en absence de NS4A. Cette association entre NS3 et NS4A assure l' activation des clivages entre NS3 / NS4A , NS4A / NS4B , NS4B / NS5A et NS5A / NS5B ( Lindenbach et al. , 2005 ) . De plus , elle permet l' interaction de NS3 avec la membrane du RE , puisque , contrairement à NS4A , NS3 ne possède pas de TMD ( Figure 8 ) . Quand NS3 est exprimée seule , elle se diffuse librement à travers la cellule ( Wolk et al. , 2000 ) . Le domaine hydrophobe N-terminal de NS4A est également nécessaire à l' adressage de NS3 dans le RE . L' extrémité C-terminale de NS3 code une hélicase à ARN ( Tai et al. , 1996 ) . Ces enzymes sont capables de dérouler des duplexes ARN-ARN . Il a été montré qu' une forme monomérique de NS3 est capable de lier l' ARN , mais que le déroulement des duplexes d' ARN nécessite un dimère ( Serebrov and Pyle , 2004 ) . L' activité hélicase est nécessaire à la réplication de l' ARN , mais l' étape précise n' est pas encore déterminée ( Lam and Frick , 2006 ) . Il serait possible que cette fonction soit active lors de l' initiation de la réplication de l' ARN , en déroulant les structures secondaires des brins positifs et négatifs de l' ARN viral . L' hélicase de NS3 pourrait également contribuer à la processivité du complexe de réplication en éliminant les structures secondaires internes et/ou en déplaçant les protéines liées à l' ARN . Il a d' ailleurs été décrit que NS3 peut interagir avec certaines protéines cellulaires ( Tellinghuisen and Rice , 2002 ) . Enfin , elle pourrait servir à dissocier la forme réplicative de l' ARN . Récemment , il a été proposé que NS3 pourrait être impliquée dans la carcinogenèse ( Deng et al. , 2006 ) . Par ailleurs , il semblerait que la protéase NS3 - 4A soit impliquée dans l' inhibition de la réponse antivirale innée chez les cellules infectées ( Evans and Seeger , 2006 ; Foy et al. , 2003 ) . Pour cela , elle est une bonne cible pour le développement de nouveaux antiviraux ( Chen and Tan , 2005 ; De Francesco and Migliaccio , 2005 ) . En effet , des peptides mimant la région C-terminale de NS3 sont capables de bloquer la protéase et d' inhiber des réplicons du VHC ( Lamarre et al. , 2003 ; Lin et al. , 2004b ; Malcolm et al. , 2006 ; Steinkuhler et al. , 1998 ) . Bien que plusieurs de ces molécules induisent l' apparition de mutations conférant une résistance dans ce système ( Lin et al. , 2005 ; Lin et al. , 2004a ; Yi et al. , 2006a ) , plusieurs essais cliniques sont actuellement en cours ( Huang et al. , 2006 ) , notamment avec le telaprevir , comme décrit précédemment . Une autre molécule , la SCH503034 , présente également une activité inhibitrice sur le système réplicon ( Malcolm et al. , 2006 ) , ainsi que chez l' homme , lors d' essais thérapeutiques chez des patients qui n' ont pas répondu au traitement à l' IFN- ? ( Huang et al. , 2006 ; Sarrazin et al. , 2007b ) . 3.2.7 . La protéine NS4B NS4B ( acides aminés de 1712 à 1972 ) est une protéine hydrophobe , associée aux membranes du RE ( Figure 8 ) ( Gretton et al. , 2005 ; Lundin et al. , 2003 ) . Elle présente quatre TMD et ses deux extrémités N- et C-terminales sont localisées dans le cytosol . Néanmoins , une fraction de l' extrémité N-terminale peut être détectée dans la lumière du RE ( Lundin et al. , 2003 ) . NS4B induit des modifications membranaires , suggérant qu' une de ses fonctions serait la formation de structures membranaires impliquées dans la réplication de l' ARN viral ( Egger et al. , 2002 ) . Toutefois , ces structures semblent légèrement différentes du réseau membranaire observé lorsque toutes les protéines virales sont exprimées , indiquant que d' autres protéines seraient également impliquées dans les modifications membranaires ( Einav et al. , 2004 ) . D' autres études suggèrent l' importance de cette protéine pour la réplication de l' ARN viral . En effet , NS4B possède un motif de liaison aux nucléotides et sa mutation affecte la réplication ( Einav et al. , 2004 ) . De plus , la palmitoylation de deux cystéines présentes à son extrémité C-terminale semble importante pour la formation du complexe de réplication ( Yu et al. , 2006 ) . Enfin , des variations de la séquence de NS4B semblent influencer l' efficacité de la réplication virale ( Blight , 2007 ) . 3.2.8 . La protéine NS5A NS5A ( acides aminés de 1973 à 2420 ) est une protéine ancrée dans les membranes du RE grâce à son domaine membranaire N-terminal ( Figure 8 ) ( Brass et al. , 2002 ; Penin et al. , 2004 ) . Elle est essentielle à la réplication du VHC ( Appel et al. , 2006 ; Seeger , 2005 ) et interagit avec NS5B , permettant le maintien de la réplication d' un réplicon subgénomique dans des cellules hépatocytaires Huh- 7 ( Shirota et al. , 2002 ) . Cette protéine est également capable de fixer l' ARN du VHC , qu' il s' agisse du brin négatif ou positif ( Huang et al. , 2005a ) . Des mutations qui améliorent la réplication de l' ARN viral en culture cellulaire ont été d' ailleurs cartographiées et certaines mutations réduisent la production de particules virales ( Appel et al. , 2005 ) . NS5A est naturellement phosphorylée et peut également être retrouvée sous forme hyperphosphorylée ( Tanji et al. , 1995 ) . La relevance de cette forme n' est pas connue , cependant des mutations qui réduisent son hyperphosphorylation conduisent à une forte augmentation de la réplication génomique du VHC ( Appel et al. , 2005 ; Evans et al. , 2004 ) . D' autres études ont montré que NS5A interagit avec différents composants de la voie de signalisation intracellulaire ( Reyes , 2002 ; Tellinghuisen and Rice , 2002 ) et qu' elle est capable d' inhiber l' induction de l' apoptose en interagissant avec certaines protéines cellulaires ( pour revue ( Fischer et al. , 2007 ) ) . Par ailleurs , sa surexpression induit une instabilité chromosomique qui est probablement impliquée dans le développement des hépatocarcinomes liés au VHC ( Baek et al. , 2006 ) . Enfin , NS5A est impliquée dans la régulation de la réponse à l' IFN ( Choi et al. , 2006 ; Machida et al. , 2006 ; Tan and Katze , 2001 ) . 3.2.9 . La protéine NS5B NS5B ( acides aminés 2421 à 3011 ) est une protéine membranaire qui assure la fonction d' ARN polymérase ARN-dépendante , présentant le motif Gly-Asp-Asp ( GDD ) caractéristique des ces enzymes ( Poch et al. , 1989 ) . Cette protéine possède un motif d' ancrage membranaire localisé à son extrémité C-terminale ( Ivashkina et al. , 2002 ) et elle est retrouvée au niveau des membranes du RE ( Figure 8 ) ( Schmidt-Mende et al. , 2001 ) . Son domaine fonctionnel enzymatique se trouve dans la région N-terminale ( Bressanelli et al. , 1999 ) et semble être modulé par des interactions avec d' autres protéines virales , telles que NS3 et NS5A ( Bartenschlager et al. , 2004 ) . La protéine NS5B joue un rôle prépondérant au sein du complexe de réplication du VHC . En effet , elle contribue à la synthèse d' ARN de polarité négative à partir du brin positif . L' ARN négatif est ensuite utilisé comme matrice pour la réplication du génome , aboutissant à un ARN de polarité positive . La structure tridimensionnelle de cette protéine révèle une forme de main droite classique avec des « doigts » , un « pouce » et une « paume » ( Bressanelli et al. , 2002 ; Bressanelli et al. , 1999 ) . Le domaine en forme de « paume » contient le site actif enzymatique alors que les « doigts » et le « pouce » forment un tunnel par lequel l' ARN est directement mené au site actif . Les nucléotides nécessaires à l' élongation de l' ARN en cours de synthèse arrivent au niveau du site actif en passant par un autre tunnel chargé positivement . L' importance de cette protéine pour le cycle viral fait d' elle une cible intéressante pour le développement de nouvelles molécules antivirales ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ) . Elles peuvent appartenir à deux groupes : les analogues de nucléosides qui s' associent au site actif ( Bressanelli et al. , 2002 ; Olsen et al. , 2004 ) et les inhibiteurs allostériques non-nucléosidiques qui se lient à des sites distants du motif GDD ( Biswal et al. , 2005 ; Ma et al. , 2005 ; Nguyen et al. , 2003 ; Tomei et al. , 2004 ) . Les analogues de nucléosides inhibent l' élongation de l' ARN , alors que les inhibiteurs allostériques agissent en inhibant l' initiation de la synthèse de l' ARN ( Di Marco et al. , 2005 ) . Parmi les analogues de nucléosides capables d' inhiber la réplication des réplicons du VHC , le NM283 réduit de manière dose-dépendante la charge virale des patients traités pendant deux semaines . Des essais cliniques en combinaison avec de l' IFN pégylé indiquent une diminution de la charge virale dans une partie significative des patients ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ) . D' autres essais cliniques sont en cours avec des inhibiteurs allostériques capables d' inhiber la réplication du VHC en culture cellulaire ( Beaulieu and Tsantrizos , 2004 ; De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ) . Cependant , plusieurs molécules antivirales ciblant NS5B induisent l' apparition de mutations conférant une résistance dans le système réplicon ( Lin et al. , 2005 ; Lin et al. , 2004a ; Mo et al. , 2005 ; Nguyen et al. , 2003 ; Tomei et al. , 2004 ) . 4 . Les modèles d' étude Bien que le clonage du VHC ait permis une analyse rapide de son organisation génomique , ainsi qu' une caractérisation biochimique de ses protéines , l' absence de système de culture cellulaire permettant son amplification efficace a constitué pendant plus de quinze ans un obstacle majeur dans l' étude du cycle infectieux de ce virus . Ces dernières années , trois modèles ont permis des avancées : les réplicons sous-génomiques , les particules rétrovirales pseudotypées avec les protéines d' enveloppe du VHC ( VHCpp ) et le virus natif infectieux en culture cellulaire ( VHCcc ) . Pendant l' attente de ce dernier , différents modèles d' étude in vitro et in vivo ont été utilisés comme modèle de susbtitution pour l' étude : du cycle viral , des interactions du virus avec l' hôte ou de l' activité antivirale des molécules utilisées contre le VHC . 4.1 . Les modèles animaux Le VHC est un virus qui , dans la nature , infecte uniquement les humains . En effet , jusqu'à présent les scientifiques n' ont jamais détecté d' autre animal infecté par ce virus de manière naturelle . Expérimentalement , le chimpanzé est le seul animal infectable par le VHC de façon reproductible ( Alter et al. , 1978a ; Alter et al. , 1978b ; Tabor et al. , 1978 ) , pouvant développer des infections aiguës ou chroniques similaires à celles observées chez l' homme . Cela a conduit à la détermination des propriétés physicochimiques du VHC ( He et al. , 1987 ; Yuasa et al. , 1991 ) . Cependant , chez le chimpanzé , la sévérité de la maladie est souvent moins importante que chez l' homme et les réponses immunitaires semblent atténuées ( Bassett et al. , 1998 ; Bassett et al. , 1999 ) . Dans un premier temps , l' infection expérimentale des chimpanzés a été réalisée par inoculation intraveineuse de plasmas humains contaminés ( Bradley et al. , 1981 ; Bradley et al. , 1985 ; Gravelle et al. , 1982 ; Tabor et al. , 1978 ) ou par inoculation intrahépatique des ARN obtenus à partir des ADN complémentaires ( ADNc ) ( Kolykhalov et al. , 1997 ; Shimizu et al. , 1998 ; Yanagi et al. , 1997 ) . Récemment , avec le développement du système cellulaire permettant la production de particules virales , il a été montré que le chimpanzé peut être infecté par ces virions produits en culture cellulaire ( Wakita et al. , 2005 ) . Ces virions infectieux issus de chimpanzés infectés ont préferentiellement une densité d' environ 1 , 09 g / mL ( Lindenbach et al. , 2006 ) . Le problème de l' utilisation de ce modèle pour l' étude du VHC est que le chimpanzé est un animal rare , protégé et son entretien est coûteux . De plus , l' Union Européenne interdit son utilisation à des fins expérimentales . Des tentatives d' infection d' autres primates , comme le marmouset ( Feinstone et al. , 1981 ) , le tamarin ( Karayiannis et al. , 1983 ) et un mammifère proche des primates , le tupaïa ( Xie et al. , 1998 ) , ont abouti à une virémie intermittente ou transitoire , sans développement d' une maladie associée . Néanmoins , une étude a montré que l' infection d' hépatocytes primaires de tupaïa par des plasmas humains contaminés par le VHC entraîne une virémie et une faible production de particules virales infectieuses in vitro ( Zhao et al. , 2002 ) . Les modèles animaux incluent également l' utilisation de souris . Le rôle des protéines du VHC dans la pathogenèse de la maladie a été analysé chez des souris transgéniques exprimant ces protéines ( Lerat et al. , 2002 ) . Cependant , ces animaux ne sont pas naturellement susceptibles à l' infection et des souris humanisées ont été développées . Ces animaux présentent une immunodéficience sévère combinée ( souris SCID ) et sont porteurs d' un transgène activateur de plasminogène ( Alb-uPA ) , ce qui conduit à une destruction de leur foie , recolonisé par des cellules de foie humain . L' infection de ces souris par des sérums humains contaminés par le VHC a permis d' établir une infection persistante et la production de particules virales infectieuses ( Mercer et al. , 2001 ) . D' autres travaux , consistant à greffer du foie humain contaminé chez des souris immunodéficientes , nommées « VHC-trimera » , ont permis de retrouver , de manière transitoire , des particules virales dans le sang des souris et d' évaluer l' effet de molécules antivirales anti-VHC sur leur charge virale ( Ilan et al. , 2002 ) . Cependant , ces modèles de souris sont très lourds à mettre en place et les animaux nécessitent une intervention chirurgicale très délicate . 4.2 . Les modèles cellulaires 4.2.1 . Les cellules infectées par du VHC isolé de sérums de patients Les hépatocytes sont considérés comme la cible naturelle du VHC in vivo . Pour cela , des hépatocytes primaires humains ou de chimpanzés ont été utilisés pour essayer d' établir un système d' infection efficace du VHC . Ces cellules ont été infectées par des sérums de patients atteints d' hépatite C chronique ( Castet et al. , 2002 ; Fournier et al. , 1998 ; Iacovacci et al. , 1997 ; Lanford et al. , 1994 ; Molina et al. , 2007 ; Molina et al. , 2008 ; Rumin et al. , 1999 ) . Une étude a également porté sur la mise en culture de cellules provenant du foie de patients chroniquement infectés par le VHC ( Ito et al. , 1996 ) . Néanmoins , dans tous ces essais , la réplication et la propagation virales étaient faibles . De plus , ces systèmes sont peu reproductibles et il est extrêmement difficile de se procurer des foies humains en bonne santé . Par ailleurs , la permissivité des hépatocytes primaires au virus est transitoire et varie en fonction du donneur , car il dépend du titre viral et de la capacité du virus à se complexer à des Ig ou à des lipoprotéines présentes dans le sérum . Ces paramètres expérimentaux étant peu contrôlables , cette méthode d' étude est difficilement standardisable . D' autres essais ont été réalisés en infectant des cellules mononuclées du sang avec des sérums de patients infectés ( Cribier et al. , 1995 ) . Ces essais ont confirmé que le VHC se réplique dans ces cellules , mais les taux de production virale étaient trop faibles pour que ce modèle serve à l' étude du cycle viral . Une autre méthode était l' utilisation de lignées cellulaires stables . La plupart de ces essais consistaient en l' utilisation de surnageant de culture d' une lignée transfectée par des ARN du VHC , pour infecter des cellules naïves de cette même lignée . Malgré la réplication de l' ARN viral dans ces systèmes , la production de particules virales restait cependant très faible ( Aizaki et al. , 2003 ; Ikeda et al. , 1998 ) . Une de ces études a réussi à montrer que même les lignées lymphocytaires T ( MOLT- 4 et MT- 2 ) et B ( Daudi ) seraient permissives à la réplication du VHC ( Shimizu et al. , 1992 ) . 4.2.2 . Les systèmes d' expression hétérologue des protéines structurales De nombreux systèmes d' expression des protéines du VHC ont été utilisés dans le but de mieux comprendre leurs fonctions . Ils reposaient sur la transfection de lignées cellulaires par des constructions plasmidiques , l' infection ou la transduction de cellules par un virus recombinant . Ces derniers ont l' avantage de permettre la production d' une grande quantité de protéines de qualité satisfaisante . Dans ce sens , les propriétés vectorielles des virus de la vaccine ou du virus Sindbis ont été utilisées pour synthétiser les protéines structurales du VHC en cellules hépatocytaires HepG 2 ( Dubuisson et al. , 1994 ) . De même , ces protéines ont été exprimées en cellules de mammifère en utilisant un vecteur adénovirus ( Seong et al. , 1998 ) . Un outil clé pour l' identification de molécules réceptrices du VHC a été les formes solubles de la glycoprotéine E2 ( Figure 9A ) . La région TMD de ces protéines a été délétée ( Michalak et al. , 1997 ) , car elle contient des signaux de rétention à la membrane du RE et d' hétérodimérisation ( Figure 12 ) ( Cocquerel et al. , 2000 ; Dubuisson et al. , 2000 ; Op De Beeck et al. , 2000 ) , des propriétés qui rendaient leur purification difficile . Figure 9 . Modèles d' étude de l' entrée du VHC dans les cellules cibles in vitro . A ) Les deux formes solubles de l' ectodomaine de la glycoprotéine d' enveloppe E2 ( sE 2 ) tronquées au niveau des acides aminés 715 et 611 sont représentées schématiquement . B ) Le système de production de pseudoparticules rétrovirales du VHC ( VHCpp ) repose sur la co-transfection des HEK-293T avec un vecteur d' expression qui code les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 du VHC sous contrôle du promoteur du cytomégalovirus ( CMV ) ; un vecteur exprimant les protéines codées par les gènes gag et pol d' un rétrovirus , MLV ou VIH ; et un troisième qui contient des séquences rétrovirales nécessaires à la transcription reverse , à l' encapsidation et à l' intégration du gène rapporteur luciférase ou GFP dans l' ADN génomique de la cellule infectée ( LTR , pour long terminal repeat ; PBS , pour primer binding site ; PPT , pour polypurine track ) . L' infection des cellules cibles est détectée par la mesure de l' activité luciférase ou de l' intensité de fluorescence . C ) Les particules du VHC en culture cellulaire ( VHCcc ) sont produites par transfection du génome JFH- 1 ( génotype 2a ) dans des cellules hépatiques Huh- 7 . La séquence codant les protéines structurales peut être remplacée par celle d' autres génotypes . Un gène rapporteur luciférase est parfois intégré dans la portion N-terminale de la protéine de capside ( C ) permettant de quantifier l' infection virale . Deux formes solubles de E2 ( sE 2 ) sont généralement utilisées : une forme tronquée en position 715 ( s E2 - 715 ) juste en amont du TMD et l' autre en position 661 ( s E2 - 661 ) ( Figure 9A ) . La forme E2 - 661 est la mieux exprimée et présente certaines caractéristiques fonctionnelles de la protéine native ( Flint et al. , 2000 ; Michalak et al. , 1997 ) . Elle a servi à l' identification de protéines cellulaires de surface impliquées dans l' entrée du VHC , telles que CD81 ( Pileri et al. , 1998 ) , le récepteur scavenger classe B de type I ( SR-BI ) ( Scarselli et al. , 2002 ) et l' héparane sulfate ( Barth et al. , 2003 ) . Bien que sE 2 ait constitué un outil très utile pour étudier l' attachement du VHC , elle ne présente pas une conformation fidèle de E2 associée à la particule virale ( Brazzoli et al. , 2005 ; Cocquerel et al. , 2003b ; Drummer et al. , 2006 ; Owsianka et al. , 2001 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les glycoprotéines E1 et E2 ont tendance à mal se replier et à former des agrégats lorsqu' elles ne sont pas associées à la membrane . De plus , Flint et collaborateurs ont montré que la forme s E2 - 661 ne reflète pas les hétérodimères présents à la surface des VHCpp et VHCcc impliqués dans l' attachement à CD81 ( Flint et al. , 2006 ) . 4.2.3 . Les pseudo-virions et virosomes Une autre méthode consistait à utiliser des baculovirus recombinants , exprimant l' ensemble des protéines structurales du VHC , pour produire , en cellules d' insecte , du matériel particulaire ressemblant à des particules du VHC ( VLP ) ( Baumert et al. , 1998 ; Choi et al. , 2004 ) . Plusieurs études ont analysé l' interaction de ces VLP avec les cellules cibles ( Chapel et al. , 2006 ; Fipaldini et al. , 1999 ; Jeong et al. , 2004 ; Martyn et al. , 2007 ; Matsuo et al. , 2006 ; McCormick et al. , 2002 ; Saunier et al. , 2003 ) . Cependant , il est important de noter que les cellules d' insecte possèdent une voie de glycosylation différente de celle des cellules de mammifères , et que la glycosylation de E1 et E2 est très importante non seulement pour le repliement correct de ces protéines , mais également pour l' entrée virale ( Goffard et al. , 2005 ) . D' autres études ont rapporté l' obtention de virus pseudotypés du virus de la stomatite vésiculaire exprimant des glycoprotéines recombinantes E1 et E2 du VHC ( Buonocore et al. , 2002 ; Lagging et al. , 1998 ; Matsuura et al. , 2001 ) . Cependant , ces protéines E1 et E2 recombinantes ne possèdaient pas leur TMD et il a été montré qu' ils sont importants pour l' hétérodimèrisation de E1E2 et pour l' entrée virale ( Ciczora et al. , 2005 ; Cocquerel et al. , 1998 ) . Une approche alternative pour analyser les phases précoces de l' entrée virale était l' incorporation des protéines d' enveloppe E1 et E2 dans des vésicules lipidiques de type liposomes ( Lambot et al. , 2002 ) . Néanmoins , ces virosomes sont difficiles à préparer , ils ne sont pas infectieux et les protéines d' enveloppe présentes à leur surface ne suivent pas la voie de sécrétion classique , n' étant donc pas correctement maturées . Enfin , un système utilisant des réplicons du virus de la forêt de Semliki exprimant les protéines de structure du VHC a été utilisé pour étudier les étapes initiales du bourgeonnement ( Blanchard et al. , 2002 ) . Par la suite , il a permis d' étudier le rôle de la capside dans la formation des particules virales et de visualiser la formation des particules dans le RE ( Roingeard et al. , 2004 ) . Néanmoins , ce système ne permet pas non plus la production de particules infectieuses . 4.2.4 . Les particules rétrovirales pseudotypées avec E1 et E2 du VHC Les particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d' enveloppe du VHC ( VHCpp ) sont des virus chimériques recombinants constitués du corps viral du virus de la leucémie murine ( MLV ) ou du VIH , des glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 du VHC et d' un gène rapporteur codant la protéine verte fluorescente ( GFP ) ou la luciférase ( Bartosch et al. , 2003c ; Drummer et al. , 2003 ; Hsu et al. , 2003 ) . Ces particules s' auto-assemblent dans les cellules embryonnaires humaines HEK-293T après transfection de trois vecteurs d' expression : le premier exprime les glycoprotéines E1 et E2 natives , le deuxième exprime les protéines codées par les gènes gag et pol du MLV ou du VIH ( matrice , capside , protéase , réverse-transcriptase et intégrase ) et le troisième exprime le gène rapporteur , qui sera le seul à être encapsidé dans la nucléocapside rétrovirale et intégré dans le génome cellulaire ( Figure 9B ) . Les protéines d' enveloppe des rétrovirus peuvent également être substituées par les protéines d' enveloppe d' autres virus . Les VHCpp sont sécrétées dans le milieu de culture cellulaire et permettent une bonne transduction de cellules , de manière dépendante de la présence de E1 et E2 à leur surface ( Figure 9B ) . Elles présentent un tropisme préférentiel pour les cellules d' origine hépatique ( Bartosch et al. , 2003c ) . De plus , elles sont neutralisées spécifiquement par des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine E2 et par des sérums de patients infectés ( Bartosch et al. , 2003a ; Bartosch et al. , 2003c ; Op De Beeck et al. , 2004 ) . Par contre , les pseudo-particules ne sont pas capables de se répliquer , permettant uniquement l' étude de l' étape d' entrée du VHC dans ses cellules cibles . 4.2.5 . Les réplicons Du fait de l' absence de systèmes cellulaires permissifs , l' étude de la réplication du VHC a été limitée jusqu'au développement des réplicons du VHC ( Lohmann et al. , 1999 ) . Les réplicons sont des ARN réplicatifs autonomes contenant typiquement une séquence codant un marqueur de sélection , comme par exemple la néomycine , sous le contrôle de l' IRES du VHC . Le gène de résistance à l' antibiotique est fusionné à la séquence N-terminale de la protéine de capside . Ensuite , l' IRES hétérologue du virus de l' encéphalomyocardite est responsable de la traduction du cadre de lecture du VHC , le tout étant encadré par les régions 5 ' NC et 3 ' NC du VHC ( pour revue ( Bartenschlager , 2006 ; Bartenschlager and Lohmann , 2001 ) . Des ARN bicistroniques compétents pour la réplication et codant la polyprotéine entière ont également été décrits ( Ikeda et al. , 2002 ; Pietschmann et al. , 2002 ) . Ces ARN génomiques , qui possèdent l' intégralité du génome viral , et les ARN sous-génomiques se répliquent de manière efficace dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 sous pression de sélection . Il a été montré que l' insertion de la séquence codant les protéines non structurales de NS3 à NS5B est nécessaire à la réplication ( Ikeda et al. , 2002 ; Lohmann et al. , 1999 ) . De plus , des mutations d' adaptation à la culture cellulaire augmentent significativement les niveaux de réplication des nouvelles cellules transfectées ( Blight et al. , 2000 ; Krieger et al. , 2001 ; Lohmann et al. , 2001 ; Lohmann et al. , 1999 ) . Un certain nombre de ces mutations ont été identifiées dans NS3 , NS4A , NS4B , NS5A et NS5B ( Blight et al. , 2000 ; Evans et al. , 2004 ; Ikeda et al. , 2002 ; Lemon , 2007 ; Neddermann et al. , 2004 ) . D' autre part , la réplication de ces ARN est fortement influencée par le status de prolifération des cellules hôtes , Huh- 7 , avec une diminution des ARN viraux lorsque les cellules atteignent une forte densité ( Pietschmann et al. , 2002 ; Scholle et al. , 2004 ) . Inversement , la synthèse de l' ARN est fortement stimulée pendant la phase S du cycle cellulaire ( Scholle et al. , 2004 ) . Les cellules avec des réplicons peuvent être « guéries » de la réplication de l' ARN du VHC par un traitement avec des concentrations modérées d' IFN- ? ( Blight et al. , 2002 ; Scholle et al. , 2004 ) . Cela a permis la sélection de cellules hautement permissives pour la réplication de l' ARN viral lorsqu' elles sont re-transfectées avec les ARN réplicons , les cellules Huh- 7.5 ( Lemon , 2007 ) . L' utilisation des réplicons a permis des avancées importantes dans l' étude de la réplication virale . Ces systèmes permettent l' étude de l' efficacité et des mécanismes d' action de molécules antivirales ciblant cette étape du cycle viral . Bien qu' aucun de ces réplicons n' ait permis la sécrétion de virions infectieux ( Blight et al. , 2003 ; Ikeda et al. , 2002 ; Pietschmann et al. , 2002 ; Sun et al. , 2004 ) , les études des clones moléculaires fonctionnels ont permis , par la suite , l' établissement du système de production virale en culture cellulaire . 4.2.6 . Les particules du VHC produites en culture cellulaire Le moyen le plus efficace et le plus pratique pour étudier un virus est de pouvoir le multiplier et le produire en culture cellulaire . En 2001 , un réplicon subgénomique de génotype 2a ( souche JFH- 1 ) a été cloné à partir d' un génome du VHC issu d' un patient japonais atteint d' une hépatite fulminante ( Kato et al. , 2003 ) . L' équipe japonaise a transcrit , à partir de l' ADNc du génome de ce clone JFH- 1 , l' ARN viral de longueur totale . La transfection de cellules hépatocytaires Huh- 7 avec cet ARN a conduit à la production de particules infectieuses ( Figure 9C ) ( Wakita et al. , 2005 ) . Ces particules virales ont été appelées VHCcc , pour VHC produit en culture cellulaire . Les VHCcc sont infectieuses sur des hépatocytes primaires humains , sur des cellules Huh- 7 naïves , chez le chimpanzé et chez des souris transplantées avec des hépatocytes humains ( Lindenbach et al. , 2005 ; Molina et al. , 2008 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) . De plus , le sérum de chimpanzé infecté par les VHCcc permet la réinfection de cellules Huh- 7 naïves ( Wakita et al. , 2005 ) . La taille des particules intracellulaires est similaire à celle des particules sécrétées , mais la densité semble différente ( Gastaminza et al. , 2006 ) . L' analyse biochimique des particules sécretées révèle une densité variant entre 1 , 15 et 1 , 17g / mL. Elles sont sphériques et mesurent environ 55 nm de diamètre ( Wakita et al. , 2005 ) . Des systèmes de culture cellulaire permettant de produire des particules infectieuses d' autres génotypes ont été décrits depuis , mais l' efficacité de ces systèmes de production est plus faible ( Kato et al. , 2007 ; Yi et al. , 2006b ) . Plusieurs études ont alors porté sur la construction de virus chimériques . Des analyses sur un virus chimérique intragénotypique constitué du génome codant les protéines C-NS2 de la souche J6 ( génotype 2a ) fusionné au génome codant les protéines NS3-NS5B de la souche JFH- 1 ( génotype 2a ) ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ) ont permis de montrer que ces chimères se répliquent et sécrètent du virus infectieux ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ) . Ces virus chimériques sont également infectieux chez le chimpanzé et les souris humanisées , et les virus issus des animaux sont également capables d' infecter les cellules Huh- 7 ( Lindenbach et al. , 2006 ) . Cette dernière étude indique que le virus récupéré des animaux est plus infectieux , mais il se modifie rapidement après un passage en culture cellulaire . En outre , il y a une différence dans la répartition de la densité des particules virales selon leur provenance ; les virus plus infectieux présentent une densité plus faible ( Lindenbach et al. , 2006 ) . La confluence des cellules au moment de l' infection semble être également importante pour la cinétique et l' éfficacité de sécretion de nouveaux virions ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . Cependant , l' inconvénient des systèmes JFH- 1 et J6 / JFH-1 est que les particules sécrétées sont issues d' un génotype 2a pour lequel on ne dispose pas suffisament d' outils . Des chimères intergénotypiques ont alors été produites avec la partie N-terminale du génome codant la polyprotéine jusqu'à NS2 des génotypes 1b ( Con 1 ) , 1a ( H77 ) , 3a ( 452 ) , 4a ( ED43 ) fusionnés à la partie NS3-NS5B du génotype 2a du JFH- 1 ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Pietschmann et al. , 2006 ; Yi et al. , 2007 ) ( Scheel 2008 ) . Afin d' améliorer la sensibilité de détection des cellules infectées , des virus chimériques exprimant un gène rapporteur , la luciférase , ont également été produits . Certains auteurs ont construit un génome viral bicistronique composé d' une part du gène rapporteur et d' autre part du génome du VHC ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . D' autres , ont produit un génome viral monocistronique dans lequel le gène de la luciférase a été fusionné à la partie 5 ' du gène de la capside ( Tscherne et al. , 2006 ) . Les deux systèmes ont montré que l' apport de la luciférase permet d' améliorer la quantification des cellules infectées . D' autre part , plusieurs équipes ont cherché à augmenter le titre infectieux puisque l' équipe de Wakita et collaborateurs obtenait une production assez faible , de l' ordre de 103 unités formant des foyers par mililitre ( ffu / ml ) ( Wakita et al. , 2005 ) . Dans un premier temps , Cai et collaborateurs ont obtenu une bonne production de particules virales infectieuses en utilisant des cellules Huh- 7 transformées stablement par l' ADN du JFH- 1 ( Cai et al. , 2005b ) . Dans un deuxième temps , les études ont porté soit sur l' utilisation de cellules hautement permissives à la réplication virale , soit sur l' utilisation de chimères , ou encore en combinant les deux facteurs . Une population clonale de cellules issues de la lignée Huh- 7.5 ( nommée Huh- 7.5.1 ) produit en effet un bon titre viral , de l' ordre de 104 - 105 ffu / ml ( Zhong et al. , 2005 ) . D' autres auteurs ont utilisé la lignée Huh- 7.5 et des virus chimériques pour obtenir une production de VHCcc plus élevée ( Lindenbach et al. , 2005 ) , de l' ordre de 105 ffu / ml . Enfin , Delgrange et collaborateurs ont sélectionné un mutant naturel de la protéine E2 présentant une mutation qui change une asparagine en position 534 en lysine . Cette mutation abolit la glycosylation du sixième site de N-glycosylation de la glycoprotéine E2 ( N6 ) et facilite la production virale ( 103 - 104 ffu / ml ) ( Delgrange et al. , 2007 ) , suggèrant que l' absence de ce glycane favorise l' interaction de E2 avec un récepteur du VHC ou alors cette mutation améliore l' assemblage et la sécretion des particules infectieuses . Dans cette étude , ils ont montré également que des mutations dans la séquence de la capside ( la mutation de la phénylalanine 172 en cystéine et de la proline 173 en sérine ) produisent des virus très infectieux ( 104 & 226;& 128;& 147; 106 ffu / ml ) ( Delgrange et al. , 2007 ) . Enfin , la combinaison des mutations de la capside avec l' abolition du sixième site de N-glycosylation de E2 produit un virus VHCcc ( JFH- 1 / CS-N6 ) encore plus infectieux que les précedents , de l' ordre de 105 - 106 ffu / ml ( Delgrange et al. , 2007 ) . Il a fallu presque vingt ans depuis la découverte du VHC pour mettre au point un système de culture cellulaire permettant l' étude in vitro de toutes les étapes du cycle réplicatif . Jusqu'à présent , cette technique a permis de valider des résultats précédemment obtenus avec d' autres systèmes , comme le rôle de E1 et E2 pour l' entrée virale ( Wakita et al. , 2005 ) , le tropisme préferentiel pour les cellules hépatiques ( Lindenbach et al. , 2005 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) et le rôle de récepteurs potentiels impliqués dans l' entrée du VHC ( Evans et al. , 2007 ; Grove et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ; von Hahn et al. , 2006 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) . Cet outil permet également le screening de nouveaux agents antiviraux spécifiques du VHC ( Lindenbach et al. , 2005 ) ou de molécules inhibant l' entrée virale ( Helle et al. , 2006 ; Lavie et al. , 2006 ) . Ce système devrait permettre de progresser encore plus dans la connaissance du cycle de ce virus . 5 . Le cycle viral L' étude du cycle viral du VHC a longtemps été freiné par l' absence de système cellulaire capable de produire des virions infectieux . Cependant , un schéma général des différentes étapes ( Figure 10 ) a pu être établi par analogie avec des virus phylogénétiquement proches , mais également grâce à l' utilisation des différents modèles décrits précédemment . Figure 10 . Cycle viral putatif du VHC . Le virus se lie à la surface des cellules sur ses récepteurs spécifiques , il est ensuite endocyté par une voie dépendante de la clathrine . L' enveloppe virale fusionne alors avec la membrane des endosomes précoces , permettant l' introduction de l' ARN viral dans le cytoplasme . Le génome sert à la synthèse des protéines virales dans le RE et , en parallèle , il sert à la synthèse de brins négatifs qui serviront de matrice pour la synthèse de nouvelles molécules d' ARN de polarité positive . Les protéines structurales servent à l' assemblage de nouvelles particules virales . L' assemblage et l' encapsidation du génome viral sont associés à des gouttelettes lipidiques ( GL ) cellulaires . Les virions suivent enfin la voie de sécrétion jusqu'à leur export hors de la cellule . 5.1 . L' entrée du VHC dans ses cellules cibles L' interaction sélective des virus animaux avec leur ( s ) récepteur ( s ) spécifique ( s ) présent ( s ) à la surface des cellules cibles est une étape essentielle à l' initiation de l' infection . Cette interaction détermine souvent le spectre d' hôtes , le tropisme cellulaire et tissulaire du virus et joue un rôle essentiel dans la pathogénicité virale . Une particule virale peut utiliser de façon séquentielle plusieurs molécules durant le processus d' attachement et d' entrée virale . De plus , différents membres d' une même population virale peuvent utiliser des molécules distinctes pour entrer dans la cellule ( Schneider-Schaulies , 2000 ) . Le VHC semble utiliser plusieurs récepteurs pour entrer dans la cellule ( Figure 11 ) . En effet , il a été décrit que la tetraspanine CD81 , le récepteur scavenger SR-BI , la claudine 1 et le glycosaminoglycane de type héparane sulfate pouvaient jouer un rôle dans l' entrée du VHC dans ses cellules cibles . Un autre candidat récepteur est le récepteur aux LDL , du fait de l' association des particules virales du VHC avec les lipoprotéines dans le sérum de patients infectés . Figure 11 . Représentation schématique de l' entrée du VHC dans ses cellules cibles . Les GAGs et le LDL-R pourraient faciliter l' attachement initial des particules virales sur les cellules , par une interaction directe avec les glycoprotéines d' enveloppe E1E2 ou par l' intermédiaire des lipoprotéines , pour les diriger vers les protéines SR-BI et CD81 . CLDN1 agit à une étape tardive du processus d' entrée , après l' attachement et l' interaction avec CD81 . Le VHC entre alors dans les cellules par endocytose dépendante de la clathrine jusqu'aux endosomes précoces où la fusion des membranes se produit et le génome est libéré dans le cytoplasme . Une fois le virus fixé à la cellule , il fusionne son enveloppe avec les membranes cellulaires permettant ainsi la libération de la nucléocapside dans le cytoplasme cellulaire et la poursuite du cycle viral . Certains virus enveloppés fusionnent à la membrane plasmique et d' autres suivent une voie d' endocytose . Pour le VHC , il a été montré qu' il est internalisé par la voie d' endocytose dépendante de la clathrine , qui conduit les particules virales vers les compartiments endosomaux . Les facteurs jouant un rôle dans l' entrée du VHC dans ses cellules cibles seront plus développés par la suite ( Cf partie III . 2 . ) . 5.2 . La synthèse des protéines et la réplication virale La synthèse des protéines virales commence par la traduction de l' ORF , aboutissant à la formation des protéines virales ( Figures Figure 7B et Figure 10 ) . L' entrée du ribosome sur la séquence de l' ARN messager se fait en amont du codon initiateur de la traduction et est relayée par l' IRES , qui occupe la majeure partie de la région 5 ' NC ( Tsukiyama-Kohara et al. , 1992 ) . Après la traduction , le découpage des protéines virales codées par l' ORF est assuré par des protéases cellulaires et virales . D' abord , une signal peptidase située dans la lumière du RE clive les protéines structurales C / E 1 , E1 / E2 , E 2 / p 7 et p 7 / NS2 . Leurs extrémités C-terminales hydrophobes jouent un rôle important dans ce processus , car elles permettent la translocation des protéines dans le RE , leur insertion dans la membrane de ce compartiment et leur clivage . Les protéines non structurales , également ancrées dans la membrane du RE , sont clivées par deux protéases virales ( Grakoui et al. , 1993 ) : la protéase NS2 associée à la partie N-terminale de NS3 , qui clive la jonction NS2 / NS3 , et la sérine protéase NS3 associée à son cofacteur NS4A , qui assure le clivage de l' ensemble des jonctions situées en aval ( NS3 / NS4A , NS4A / NS4B , NS4B / NS5A et NS5A / NS5B ) ( Grakoui et al. , 1993 ) . Le complexe de réplication se forme pendant la maturation de la polyprotéine précurseur et il contient l' ARN polymérase dépendante de l' ARN ( NS5B ) , les autres protéines non structurales ( NS3 à 5A ) , des protéines cellulaires et l' ARN viral ( Ishido et al. , 1998 ) . La protéine NS2 ne semble pas être nécessaire à ce complexe , puisque des réplicons dépourvus de NS2 sont fonctionnels . Le complexe de réplication est associé aux structures membranaires et vésiculaires périnucléaires , qui semblent être le siège de la réplication virale . En effet , une altération spécifique des membranes , appelée réseau membranaire , a été identifiée comme étant le siège de réplication dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 contenant un réplicon subgénomique du VHC ( Gosert et al. , 2003 ) . Ce réseau membranaire peut être induit par NS4B seule et ressemble aux « inclusions de type éponge » observées dans des images de microscopie électronique de foie de chimpanzés infectés par le VHC ( Egger et al. , 2002 ) . Il est admis que le réseau membranaire dérive des membranes du RE . Une fois le complexe de réplication mis en place dans le réseau membranaire , l' ARN polymérase synthétise un brin d' ARN négatif à partir du génome , qui servira ensuite de matrice pour la synthèse de nombreux brins d' ARN positifs . Ces ARN seront encapsidés et enveloppés pour devenir les génomes des particules virales néoformées ou serviront de nouveaux messagers pour la synthèse de nouvelles protéines virales . 5.3 . L' assemblage et la sécrétion virale Les dernières étapes du cycle viral sont très mal connues . L' assemblage est probablement déclenché par l' interaction entre l' ARN génomique et la protéine de capside , qui aboutit à la formation de la nucléocapside par des mécanismes non encore élucidés ( Figure 10 ) ( Shimoike et al. , 1999 ) . En particulier , aucun signal d' encapsidation spécifique n' a été identifié . Par analogie avec les Flavivirus , les nucléocapsides du VHC pourraient s' envelopper par bourgeonnement à l' intérieur du RE , éventuellement sous l' influence d' interactions entre la protéine de capside et les glycoprotéines d' enveloppe . Les virions seraient ensuite secrétés par exocytose . Récemment , il a été montré que dans le système des VHCcc , la protéine de capside est associée aux GL ( Boulant et al. , 2007 ; Miyanari et al. , 2007 ; Rouille et al. , 2006 ; Shavinskaya et al. , 2007 ) , comme décrit avec d' autres systèmes ( Dubuisson et al. , 2002 ; Hope and McLauchlan , 2000 ; McLauchlan , 2000 ; McLauchlan et al. , 2002 ) . Ces études montrent que la protéine de capside recrute les protéines non-structurales , notamment NS5A , et les ARN viraux négatifs et positifs vers les GL ( Miyanari et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , tandis que la capside et les GL colocalisent , une fraction des protéines NS et les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 se localisent autour du complexe capside-GL ( Miyanari et al. , 2007 ; Rouille et al. , 2006 ) . La protéine de capside est également associée à un compartiment membranaire lui-même associé aux GL ( Rouille et al. , 2006 ) . De manière importante , il a été montré que l' association des protéines virales , de l' ARN viral et des GL , à proximité de ces compartiments membranaires associés aux GL , est essentiel pour la production de nouvelles particules virales ( Miyanari et al. , 2007 ) . De plus , il semblerait que l' attachement de la capside aux GL se fait après son clivage par la SPP , qui serait déterminant pour la production de particules infectieuses ( Targett-Adams et al. , 2008 ) . Bien que d' autres protéines non structurales semblent être impliquées dans la production de particules infectieuses , comme p 7 et NS2 ( Jones et al. , 2007 ; Steinmann et al. , 2007 ) , NS5A serait nécessaire pour leur association aux complexes capside-GL ( Miyanari et al. , 2007 ) . Dans ce sens , le domaine III de NS5A , et plus spécifiquement la phosphorylation de la sérine 457 par des kinases cellulaires , semble être important pour l' assemblage de virions infectieux ( Appel et al. , 2008 ; Tellinghuisen et al. , 2008 ) . De plus , la délétion du domaine III de NS5A empêche sa co-localisation avec la protéine de capside et les GL , ainsi que la production de particules infectieuses ( Appel et al. , 2008 ) . Il a également été montré que la production virale par les hépatocytes était dépendante de l' assemblage et de la sécrétion des VLDL ( Gastaminza et al. , 2008 ; Huang et al. , 2007 ) . Spécifiquement , le niveau de l' apolipoprotéine B semble être limitant pour l' assemblage des particules infectieuses et la sécrétion des particules dépend de la protéine de transfert microsomal ( MTP ) du RE , responsable de l' assemblage des VLDL ( Gastaminza et al. , 2008 ) . Dans ce sens , il a été montré que les particules virales sont assemblées dans un compartiment intracellulaire sous forme de particules de forte densité ( > 1 , 15g / mL ) , mais qu' elles acquièrent des éléments qui leur confèrent une faible densité ( < 1 , 14g / mL ) durant leur sécrétion ( Gastaminza et al. , 2006 ) . Des mutations empêchant l' association de la protéine de capside aux GL bloquent la production de particules infectieuses de basse densité , alors que les particules non-infectieuses de haute densité semblent suivre une voie différente ( Miyanari et al. , 2007 ) . Le travail de Gastaminza et collaborateurs indique qu' une partie des particules intracellulaires ou des composants essentiels à leur assemblage sont dégradés de manière dépendante de cystéine protéases cellulaires . Cependant , les particules virales de basse densité échappent à la dégradation et sont sécretées dans le milieu extracellulaire ( Gastaminza et al. , 2008 ) . De manière intéressante , les cystéine protéases participent également à la dégradation post-RE des apolipoprotéines B et E ( Adeli , 1994 ; Ye et al. , 1993 ) et , chez les patients infectés , les particules du VHC sont associées à ces apolipoprotéines ( Andre et al. , 2002 ; Nielsen et al. , 2006 ) . Gastaminza et collaborateurs proposent que les particules précurseurs du VHC sont ciblées vers la dégradation , si leur maturation post-RE ( par exemple l' addition de lipides ) n' a pas lieu ( Gastaminza et al. , 2008 ) . L' assemblage de ces particules précurseurs se fait dans le RE de manière dépendante de la MTP et leur maturation post-RE est nécessaire à la sécrétion . Ces études indiquent que l' interaction de la protéine de capside ou des nucléocapsides néoformées avec le métabolisme des lipides pourrait jouer un rôle dans la maturation des virions et expliquer la présence , dans le sang circulant , de particules virales associées aux lipoprotéines , qui constituent d' ailleurs la majeure partie de la fraction infectieuse . III . L' entrée du VHC dans ses cellules cibles 1 . Les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 Les glycoprotéines d' enveloppe du VHC jouent des rôles majeurs à différentes étapes du cycle viral . En effet , elles participent à la formation des particules virales infectieuses ( Wakita et al. , 2005 ) et sont essentielles à l' entrée des virus dans les cellules cibles ( pour revue ( Cocquerel et al. , 2006 ) . Les deux glycoprotéines E1 ( acides aminés 192 à 383 ) et E2 ( acides aminés 384 à 746 ) sont produites après clivage de la polyprotéine précurseur par des peptidases signal ( Dubuisson et al. , 2002 ) ( Figures 7B , 8 et 12 ) . Le clivage au niveau des sites C / E 1 , E1 / E2 et E 2 / p 7 / NS2 produit E1 et un précurseur E 2 -p 7 -NS2 . Celui  -ci est très rapidement clivé pour libérer E2 , une forme E 2 -p 7 et NS2 ( Dubuisson et al. , 1994 ) . E1 et E2 sont des protéines membranaires de type I avec un large ectodomaine N-terminal hautement N-glycosylé et un TMD C-terminal constitué d' un seul passage ( Figure 12A ) . Lors de la traduction de l' ORF , le domaine 3 de la protéine de capside est responsable du signal de clivage entre C et E1 , ainsi que de la translocation de l' ectodomaine de E1 dans la lumière du RE ( Santolini et al. , 1994 ) . L' ectodomaine de la protéine E2 est également dirigé vers la lumière du RE par un signal présent dans le TMD de E1 ( Cocquerel et al. , 1999 ; Cocquerel et al. , 2000 ) . Les TMD des deux glycoprotéines sont ensuite ancrés dans la membrane du RE ( Figure 8 ) et les glycoprotéines forment des hétérodimères E1E2 qui sont retenus au niveau de ce compartiment . Les TMD de E1 et E2 ont été largement caractérisés dans le laboratoire et il a été montré que ceux  -ci sont multifonctionnels ( Figure 12A ) . En effet , en plus de leur fonction d' ancrage membranaire et d' adressage , ces domaines sont responsables de la rétention stricte des hétérodimères E1E2 dans le RE ( Cocquerel et al. , 1999 ; Cocquerel et al. , 1998 ; Cocquerel et al. , 2000 ) . Ils sont également impliqués dans l' hétérodimérisation des deux glycoprotéines et jouent un rôle dans l' entrée virale ( Ciczora et al. , 2005 ) . De plus , il a été montré que la mutation de certains résidus des TMD de E1 et de E2 altère la propriété de fusion de ces glycoprotéines d' enveloppe suggérant qu' ils jouent également un rôle majeur dans le mécanisme de fusion ( Ciczora et al. , 2007 ) . Enfin , il a été montré que des résidus chargés présents dans les TMD de E1 et de E2 sont importants pour la multifonctionnalité de ces domaines ( Cocquerel et al. , 2000 ) et cette multifonctionnalité est liée à une dynamique topologique ( Cocquerel et al. , 2002 ) . Figure 12 . Représentation schématique de l' organisation structurale et fonctionnelle des glycoprotéines d' enveloppe du VHC . Des schémas consensuels de l' organisation des domaines structuraux de E1 et E2 sont représentés . Les N-glycanes , en rouge , sont positionnés au dessus ; les peptides de fusion prédits sont en jaune ; les régions HVR , en vert ; et les TMD , en rose . Les résidus de E2 impliqués dans l' interaction avec la molécule CD81 sont indiqués par des flèches bleues : W437 , L438 , L441 , P442 ( Drummer et al. , J. Virol . 2006 ) , W420 , Y527 , W529 , G 530 , D535 ( Owsianka et al. , J. Virol . 2006 ) . Au cours de leur passage dans le RE , les glycoprotéines E1 et E2 peuvent former deux types de complexes : les hétérodimères non covalents et les agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures ( Deleersnyder et al. , 1997 ; Dubuisson et al. , 1994 ) . Il est admis que la forme fonctionnelle soit la première . D' autre part , le repliement de la protéine E1 est dépendant de la co-expression de E2 , alors que la protéine E2 peut atteindre un état conformationnel avancé en absence de E1 ( Michalak et al. , 1997 ) . D' ailleurs , l' interaction entre les TMD des deux protéines est indispensable au repliement de E1 ( Dubuisson et al. , 2000 ) , mais ne semble influencer que les étapes finales du repliement de E2 ( Cocquerel et al. , 2002 ) . La mise en conformation de ces deux glycoprotéines est contrôlée par les protéines chaperones du RE , telles que la calnexine , qui s' associe plutôt aux hétérodimères non-covalents , et les protéines calréticuline et BiP , qui interagissent préférentiellement avec les agrégats covalents ( Choukhi et al. , 1998 ) . Par ailleurs , E2 contient une région hypervariable d' environ 27 acides aminés ( 384 à 410 ) , appelée HVR1 . La forte variabilité de cette région pourrait permettre aux virus d' échapper au système immunitaire . En effet , des virus délétés de cette région présentent une infection atténuée chez le chimpanzé ( Forns et al. , 2000 ) . Malgré la variabilité de cette séquence , ses propriétés physico-chimiques et sa conformation spatiale sont relativement conservées à travers les différents génotypes ( Penin et al. , 2001 ) . Elle est composée de plusieurs acides aminés basiques qui modulent l' infectiosité du VHC ( Callens et al. , 2005 ) . D' autres régions hypervariables pouvant jouer un rôle dans l' entrée virale ont été décrites : HVR2 ( résidus 474 à 482 ) ( Roccasecca et al. , 2003 ; Weiner et al. , 1991 ) et HVR3 ( résidus 431 à 466 ) ( Troesch et al. , 2006 ) . La région HVR2 est d' ailleurs très conservée parmi les isolats du VHC ( McCaffrey et al. , 2007 ) . La glycoprotéine E2 serait plutôt responsable de l' attachement de la particule virale aux cellules cibles en interagissant avec les différentes molécules qui jouent un rôle dans l' entrée virale . Le rôle de E1 dans l' infection est moins bien établi . Cependant , plusieurs anticorps dirigés contre E1 sont capables de neutraliser l' entrée ( Dreux et al. , 2006 ; Keck et al. , 2004 ; Pietschmann et al. , 2006 ) , ainsi que des anticorps conformationnels reconnaissant les hétérodimères E1E2 ( Drummer et al. , 2006 ; Flint et al. , 1999a ; Hadlock et al. , 2000 ) . Il a été montré que les niveaux d' incorporation de E1 seule sur les VHCpp sont réduits et que ces particules ne sont pas infectieuses . Les deux glycoprotéines doivent alors être incorporées sur les particules pour permettre une production virale efficace ( Bartosch et al. , 2003d ; Hsu et al. , 2003 ) . L' utilisation des formes sE 2 a permis l' identification de récepteurs putatifs pour le VHC , dont CD81 ( Pileri et al. , 1998 ) . Cependant , des formes tronquées intracellulaires de E2 s' associent à CD81 avec une plus grande affinité que les formes sécrétées ( Flint et al. , 2000 ; Heile et al. , 2000 ) , suggérant que des différences structurales existent entre les formes sécrétées et les formes intracellulaires de E2 . En effet , certains anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels de E2 ne reconnaissent pas la forme s E2 - 661 ni E2 exprimée en absence de E1 . Ceci suggère que des différences de conformation existent entre les hétérodimères E1E2 et les glycoprotéines exprimées seules ( Cocquerel et al. , 2003b ) . L' interaction de CD81 avec des hétérodimères E1E2 se fait d' ailleurs avec une plus forte affinité que l' interaction CD81 / sE 2 ( Cocquerel et al. , 2003a ) . Par ailleurs , la forme sE 2 de génotype 1a possède une plus forte affinité pour CD81 que les sE 2 d' autres génotypes . Cependant , les VHCpp- 1b infectent les cellules de manière dépendante de CD81 , suggérant que l' interaction entre CD81 et sE 2 ne prédit pas l' interaction de CD81 avec les VHCpp ( Zhang et al. , 2004a ) . En effet , des différences ont été observées en comparant les interactions sE 2 -CD81 et l' infectiosité de VHCpp et VHCcc ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Flint et al. , 2006 ; Zhang et al. , 2004a ) . L' expression de la CD81 de différentes espèces dans les cellules HepG 2 permet de les rendre permissives à l' infection des VHCcc et VHCpp , alors que la forme sE 2 ne s' associe qu' aux HepG 2 exprimant la CD81 humaine , de chimpanzé et de tamarin ( Flint et al. , 2006 ) . De plus , une mutation dans la séquence de CD81 qui dissociait son interaction avec sE 2 permet également de rendre les HepG 2 permissives aux VHCpp ( Zhang et al. , 2004a ) . Les ectodomaines des protéines E1 et E2 sont hautement glycosylés ( Figure 12B ) . La protéine E1 contient quatre site de glycosylation très conservés ( positions 196 , 209 , 234 et 305 ) . D' autres sites potentiels ne sont conservés que dans certains génotypes : un site en position 250 dans les séquences de génotypes 1b et 6 et un autre site en position 299 dans le génotype 2b ( Figure 12B ) ( Goffard and Dubuisson , 2003 ; Zhang et al. , 2004b ) . La protéine E2 possède neuf sites potentiels de glycosylation très conservés dans tous les génotypes ( positions 417 , 423 , 430 , 448 , 532 , 576 , 623 et 645 ) ( Figure 12B ) . Un site en position 476 semble rarement présent dans les séquences de génotype 1b et un autre site , en position 540 est absent des génotypes 3 et de la majorité des génotypes 6 . Malgré la forte variabilité du VHC , la conservation importante des sites de glycosylation suggère un rôle essentiel des glycanes dans le cycle viral . Dans le RE , les sites de glycosylation de E1 et E2 sont modifiés par N-glycosylation ( Goffard et al. , 2005 ; Goffard and Dubuisson , 2003 ) et la présence de E2 est indispensable pour que la protéine E1 soit correctement glycosylée ( Dubuisson et al. , 2000 ) . Toutefois , ce phénomène ne semble pas dépendre d' une séquence spécifique de E2 . Par ailleurs , les glycoprotéines associées aux VHCpp contiennent des glycanes complexes , suggérant que certains sont probablement modifiés par des enzymes du Golgi ( Op De Beeck et al. , 2004 ) et sont très probablement modifiés après l' assemblage et le relargage des particules virales ( Flint et al. , 2004 ; Lozach et al. , 2004 ; Op De Beeck et al. , 2004 ) . L' étude du rôle fonctionnel des glycanes associés aux protéines d' enveloppe du VHC a montré qu' ils jouaient un rôle majeur dans le repliement de ces protéines , ainsi que dans l' entrée virale ( Goffard et al. , 2005 ) . En effet , certains glycanes sont importants pour le repliement et l' hétérodimèrisation de E1 et E2 , tandis que d' autres modulent l' infectiosité des VHCpp . Par exemple , les glycanes de E2 en position 417 , 532 et 645 réduisent la sensibilité des VHCpp à des anticorps neutralisants et diminuent également l' accessibilité de CD81 à son site d' association sur E2 ( Falkowska et al. , 2007 ; Helle et al. , 2007 ) . Ceci indique que ces glycanes sont proches de la région de E2 interagissant avec CD81 et que cette région est une cible majeure des anticorps neutralisants . De plus , la glycosylation de ces trois sites , qui protégent le site d' association à CD81 de la neutralisation , est hautement conservée ( Helle et al. , 2007 ) . De manière intéressante , une mutation adaptative abolissant le sixième site de N-glycosylation de E2 ( en position 532 ) augmente l' infectiosité des VHCcc ( Delgrange et al. , 2007 ) . Les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 sont des cibles intéressantes pour le développement de nouveaux anti-viraux . En effet , une lectine issue de cyano-bactéries , la Cyanovirin-N , possède une haute spécificité pour les glycanes présents à la surface virale et inhibe l' entrée du VHC ( Helle et al. , 2006 ) . De plus , il a été montré pour d' autres virus glycosylés , comme le VIH , que des drogues dirigées contre les glycanes présents sur les protéines d' enveloppe , comme la chloroquine et ses analogues , en combinaison avec le traitement classique , diminue la charge virale ( Boelaert et al. , 1999 ; Paton and Aboulhab , 2005 ; Romanelli et al. , 2004 ; Sperber et al. , 1995 ) . Cette approche pourrait être appliquée à d' autres virus glycosylés , car la chloroquine s' accumule dans l' endosome empêchant son acidification , une étape importante pour la fusion et l' entrée dans le cytoplasme cellulaire pour de nombreux virus , comme le VHC . La chloroquine peut également affecter l' activité des glycosyltransférases dans le RE et l' appareil de Golgi , empéchant l' addition de glycanes sur les protéines et l' association avec les protéines chaperon du RE , calnexine et calréticuline . Sans l' assistance de ces protéines chaperones , les protéines virales , comme E1 et E2 , ne sont pas correctement repliées et ne sont pas fonctionnelles ( Vigerust and Shepherd , 2007 ) . Des inhibiteurs de glucosidases pourraient également être utilisés contre le VHC . En ce qui concerne le VHC , en utilisant les sytèmes VLP , VHCpp et VHCcc , il a été montré que les inhibiteurs de glucosidase entraînent un mauvais repliement des protéines d' enveloppe et une mauvaise interaction des particules avec les cellules , ce qui diminue l' infectiosité des particules virales ( Chapel et al. , 2007 ; Chapel et al. , 2006 ) . Bien que ces inhibiteurs ciblent des enzymes cellulaires , la maturation des protéines cellulaires ne semble pas affectée . Le mauvais repliement des protéines virales aurait une conséquence dramatique sur l' assemblage des particules virales , alors que les protéines cellulaires passeraient le contrôle qualité du RE et resteraient biologiquement actives même après quelques changements au niveau de leur glycosylation ( Rudd and Dwek , 1997 ) . 2 . Les protéines cellulaires impliquées dans l' entrée du VHC 2.1 . Les molécules d' attachement Des formes recombinantes de la protéine E2 , des VHCpp et des particules virales présentes dans le sérum de patients infectés interagissent spécifiquement avec les lectines DC-SIGN et L-SIGN ( Cormier et al. , 2004a ; Gardner et al. , 2003 ; Lozach et al. , 2004 ; Lozach et al. , 2003 ; Pohlmann et al. , 2003 ) . Ces molécules sont des lectines de type C capables de reconnaître des structures glycanes de manière dépendante du calcium . L-SIGN est exprimée , entre autres , à la surface des cellules de l' endothélium bordant les capillaires sinusoïdes du foie ( Pohlmann et al. , 2001 ) . De son côté , DC-SIGN est rétrouvée à la surface des cellules dendritiques et de quelques populations de macrophages , comme les cellules de Kupffer , qui se localisent dans le parenchyme hépatique ( Soilleux et al. , 2002 ) . Ces deux lectines sont capables de reconnaître des structures glycaniques à la surface de certains pathogènes ( Koppel et al. , 2005 ) . Il a été montré que la liaison de E2 à L-SIGN pouvait induire la transmission de VHCpp à des cellules hépatiques adjacentes ( Cormier et al. , 2004a ; Gardner et al. , 2003 ) . Etant donné que L-SIGN et DC-SIGN ne sont pas exprimées à la surface des hépatocytes , elles ne peuvent pas être des récepteurs spécifiques de ces cellules . Dans ce sens , il a été montré qu' elles ne permettent pas l' entrée des VHCpp et VHCcc ( Lai et al. , 2006 ) . Il est envisageable qu' elles contribueraient à l' établissement de l' infection persistante en capturant et concentrant le virus dans les hépatocytes . Cependant , ce processus doit encore être démontré in vivo . Une autre lectine de type C , le récepteur aux asialoglycoprotéines , a été proposée comme récepteur pour le VHC ( Saunier et al. , 2003 ) . Elle est localisée principalement à la surface des hépatocytes ( Stockert , 1995 ) ) et peut interagir avec les VLPs produites dans des cellules d' insectes ( Saunier et al. , 2003 ) . Néanmoins , ces données n' ont jamais été confirmées dans d' autres systèmes . Une autre molécule qui semble participer à l' attachement du VHC est le glycosaminoglycane héparane sulfate présent à la surface des hépatocytes ( Figure 11 ) . Les glycosaminoglycanes ( GAG ) sont caractérisés par une grande hétérogénéité structurale leur permettant d' interagir spécifiquement avec de nombreuses protéines et ils servent de premier point d' attache cellulaire pour certains virus avant l' interaction avec leur ( s ) récepteur ( s ) ( Villanueva et al. , 2005 ) . D' autres virus , comme le virus de la dengue et celui de la fièvre jaune , s' en servent comme récepteur d' entrée ( Chen et al. , 1997 ; Germi et al. , 2002b ) . Par rapport au VHC , il a été montré que la protéine E2 interagit spécifiquement avec l' héparane sulfate présent à la surface des lignées humaines d' origine hépatique ( Barth et al. , 2003 ) . Par contre , aucune interaction directe avec E2 isolée des VHCpp n' a été démontrée ( Callens et al. , 2005 ) . L' héparine ( homologue structurale des héparane sulfates ) , des héparinases et le dextrane sulfate sont capables de diminuer l' attachement de particules virales présentes dans le sérum de patients infectés , de pseudoparticules arborant E1 et E2 chimériques et des VHCcc aux cellules cibles , ainsi que d' inhiber l' infection des VHCcc dans ces cellules ( Cribier et al. , 1998 ; Germi et al. , 2002a ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Meyer et al. , 2000 ) . Des expériences de cinétique à 4 °C et à 37 °C suggérent que les GAG ne sont pas des récepteurs proprements dits du VHC , mais facilitent plutôt l' attachement des VHCcc à la surface des cellules ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Il est possible que le VHC interagisse avec les GAG de façon indirecte , via les lipoprotéines associées aux particules virales . Dans ce sens , la lipoprotéine lipase ( LPL ) permet une interaction indirecte entre le VHC et les GAG ( Andreo et al. , 2007 ) . Néanmoins , l' attachement des particules virales via la LPL semble diriger les particules vers une voie non-productive , puisqu' elle inhibe l' infection par les VHCcc . La participation du récepteur des lipoprotéines de faible densité ( LDL-R ) dans l' entrée virale a également été proposée ( Figure 11 ) . En effet , plusieurs observations suggèrent cette participation . D' abord , il a été observé que chez les patients VHC positifs présentant une cryoglobulinémie mixte , les lésions cutanées causées par les complexes de cryoglobulines sont associées à une augmentation du niveau d' expression de LDL-R ( Agnello and Abel , 1997 ) . De plus , dans le sérum des patients infectés , les particules infectieuses sont associées à des LDL et des VLDL ( Andre et al. , 2002 ) , suggèrant que le VHC pourrait se servir de sa couverture de lipoprotéines pour utiliser le LDL-R comme récepteur d' entrée dans les cellules cibles . Dans ce sens , des anti-LDL-R , des anti-apolipoprotéines B et E , ainsi que des VLDL et des LDL purifiées inhibent l' entrée du VHC ( Agnello et al. , 1999 ; Bartosch et al. , 2003c ; Chang et al. , 2007 ; Germi et al. , 2002a ; Monazahian et al. , 1999 ; Wunschmann et al. , 2000 ) . Les VLDL pourraient participer à la morphogenèse du virus dans ces cellules , comme expliqué précédemment . De plus , il existe une correlation entre l' accumulation de l' ARN du VHC dans les hépatocytes primaires , l' expression de l' ARN messager du LDL-R et l' entrée des LDL ( Molina et al. , 2007 ) . Il a été suggéré que E2 interagirait avec les LDL pour former un complexe qui augmenterait l' affinité du virus pour les LDL-R et faciliterait l' introduction du virus dans la cellule ( Nahmias et al. , 2006 ; Wunschmann et al. , 2006 ) . Néanmoins , le LDL-R est exprimé également à la surface de cellules non permissives au VHC ( Bartosch et al. , 2003c ) , suggérant qu' il n' est pas la seule voie d' entrée des particules . 2.2 . Les récepteurs 2.2.1 . La tétraspanine CD81 La structure de CD81 CD81 est une protéine appartenant à la famille des tétraspanines . Ces protéines sont composées de quatre TMD , deux boucles extracellulaires , une petite ( SEL ) et une grande ( LEL ) , et des extrémités N- et C-terminales intracellulaires ( Figures 11 et 13 ) ( Levy and Shoham , 2005c ) . La structure de la LEL de CD81 a été analysée par diffraction aux rayons X après cristallisation . Kitadokoro et collaborateurs ont ainsi obtenu un dimère de domaines LEL , chacun constitué de cinq hélices ? organisées en deux domaines : les hélices A et E interagissent entre elles pour former un « pied » coiffé des trois autres hélices ( B , C et D ) . Cette « coiffe » est stabilisée par deux ponts disulfures ( Kitadokoro et al. , 2001 ) . Le « pied » contient une face hydrophobe qui participerait à la dimérisation du domaine LEL en solution , mais pourrait être impliquée dans d' autres types d' interactions dans la molécule entière , notamment avec la SEL ( Seigneuret , 2006 ) ( Figure 13B ) . Par ailleurs , les hélices C et D présentent une grande variabilité de séquence entre les différentes tétraspanines humaines , avec seulement 6 , 7 % de résidus conservés ( Stipp et al. , 2003b ) . Ce domaine plus variable pourrait donner la spécificité à chaque tétraspanine ( Bienstock and Barrett , 2001 ; Seigneuret et al. , 2001 ) . Figure 13 . Organisation de la tétraspanine CD81 . A ) Représentation schematique de CD81 ( d' après Levy G = glycine ; N = asparagine ; E = acide glutamique . B ) Structure des hélices a de la LEL . A et E forment un « pied » coiffé par B , C et D. Le domaine variable constitué des hélices C et D est représenté en rouge ( d' après Seigneuret et al. , JBC 2001 ) . CD81 joue un rôle dans l' entrée du VHC En 1998 , Pileri et collaborateurs ont identifié la tétraspanine CD81 en tant que récepteur du VHC ( Figures 11 et 13 ) . Cette découverte a été réalisée en utilisant une banque d' ADNc dérivée d' une lignée de lymphocytes T ( Molt- 4 ) qui présentait une haute capacité d' interaction avec sE 2 du VHC . Ils ont montré que cette interaction pouvait être spécifiquement inhibée par des anticorps dirigés contre CD81 . De plus , une forme soluble de la LEL de CD81 humaine pouvait se lier à sE 2 . L' interaction entre sE 2 et la CD81 humaine était inhibée par du sérum de chimpanzés vaccinés avec sE 2 , démontrant la relevance physiologique de cette interaction ( Pileri et al. , 1998 ) . L' interaction de E2 avec CD81 est spécifique de cette tétraspanine car d' autres tétraspanines telles que CD9 , CD63 et CD151 ne se lient pas à E2 ( Flint et al. , 1999a ; Zhang et al. , 2004a ) . Le rôle de CD81 dans l' infection du VHC a été confirmé avec les VHCpp et VHCcc . En effet , l' entrée de ces particules virales est inhibée par des anticorps dirigés contre CD81 , ainsi que par une forme soluble de la LEL de CD81 ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhang et al. , 2004a ; Zhong et al. , 2005 ) . En outre , l' utilisation d' ARN intérferents réduisant l' expression de CD81 dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 diminue remarquablement l' infection par les VHCpp , VHCcc et particules dérivées de sérums de patients infectés ( Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2007 ; Molina et al. , 2008 ; Zeisel et al. , 2007 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les VHCpp et VHCcc ont d' ailleurs un tropisme préferentiel pour les lignées hépatiques humaines exprimant CD81 ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Evans et al. , 2007 ; Flint et al. , 2006 ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; Lindenbach et al. , 2006 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhang et al. , 2004a ; Zhong et al. , 2005 ) et CD81 est nécessaire à l' entrée des VHCpp de tous les génotypes ( Lavillette et al. , 2005b ; McKeating et al. , 2004 ) . Cependant , il semblerait que l' affinité de E2 pour CD81 diffère selon le génotype viral ( Roccasecca et al. , 2003 ; Shaw et al. , 2003 ; Yagnik et al. , 2000 ) . Enfin , l' expression ectopique de CD81 humaine dans les cellules hépatocytaires humaines HepG 2 , qui n' expriment pas de CD81 , permet de les rendre permissives aux VHCpp ou VHCcc ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Flint et al. , 2006 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; McKeating et al. , 2004 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les résidus de CD81 importants pour son interaction avec E2 Différentes études ont contribué à identifier la région et les résidus de CD81 impliqués dans l' interaction avec E2 . Il a été montré que la LEL de CD81 est la région responsable de son interaction avec E2 ( Pileri et al. , 1998 ; Zhang et al. , 2004a ) et que les ponts disulfures de la LEL sont nécessaires à la reconnaissance de CD81 par sE 2 ( Drummer et al. , 2002 ; Petracca et al. , 2000 ) . La comparaison entre la CD81 humaine , celle du singe vert d' Afrique et celle du tamarin a permis d' identifier le résidu F186 comme crucial pour l' interaction avec E2 ( Flint et al. , 1999a ; Higginbottom et al. , 2000 ; Kitadokoro et al. , 2001 ; Meola et al. , 2000 ; Pileri et al. , 1998 ) . En effet , la LEL de CD81 du singe vert d' Afrique , qui possède un résidu différent à cette position , ne se lie pas à sE 2 , alors que la LEL de CD81 du tamarin s' associe à E2 et possède le même résidu que chez l' homme . D' autres résidus présents dans le domaine formé par les hélices C et D , tels que L162 , I181 , I182 , N184 et L185 , ont également été identifiés ( Drummer et al. , 2002 ; Kitadokoro et al. , 2001 ) . Des molécules mimant l' hélice D de CD81 sont d' ailleurs capables d' inhiber compétitivement l' association entre E2 et CD81 ( VanCompernolle et al. , 2003 ) . Néanmoins , ces études ont été réalisées en utilisant des formes solubles de CD81 et de E2 . Des différences d' association avec E2 ont pu être observées entre la LEL soluble et la molécule CD81 entière ( Drummer et al. , 2005 ; Flint et al. , 2006 ) . Des différences structurales existent également entre les formes tronquées et les formes natives de E2 , comme expliqué précédemment . Des mutations dans la séquence de la LEL humaine ( 182 , 184 et 186 ) avaient été associées à une diminution de l' interaction entre CD81 et sE 2 . Toutefois elles inhibent peu ou pas l' infection des VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Flint et al. , 2006 ) . L' étude de Bertaux et collaborateurs suggère que d' autres régions de la molécule de CD81 , comme la région C-terminale , la palmitoylation des cystéines juxtamembranaires et les résidus transmembranaires C80 et N18 / E219 seraient importants pour l' interaction avec les VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ) . La SEL de CD81 pourrait également être importante pour l' infection , car elle est nécessaire à l' expression optimale de CD81 à la surface cellulaire ( Masciopinto et al. , 2001 ) . Cependant , Flint et collaborateurs ont montré que des protéines chimériques de rat exprimant la LEL humaine sont capables de rendre les HepG 2 permissives à l' infection des VHCpp et VHCcc , tandis que des protéines chimériques humaines exprimant la LEL de rat ne rendent pas ces cellules infectables ( Flint et al. , 2006 ) . Ceci indique que la LEL est la région de CD81 qui définit l' infection par le VHC . Les résidus de E2 importants pour son interaction avec CD81 Des régions et résidus de E2 importants pour son interaction avec CD81 ont également était identifiés ( Figure 12B ) . Le site de E2 responsable de son interaction avec CD81 serait conformationnel ( Drummer et al. , 2006 ; Flint et al. , 1999a ; Hadlock et al. , 2000 ) . Des études réalisées avec sE 2 , des hétérodimères E1E2 ou des VLP ont identifié plusieurs régions de E2 importantes pour son interaction avec CD81 , entre les résidus : 412 - 447 ( Hsu et al. , 2003 ; McCaffrey et al. , 2007 ; Owsianka et al. , 2001 ) ; 480 - 493 ( Flint et al. , 1999a ; Owsianka et al. , 2001 ; Patel et al. , 2000 ) ; 528 - 535 ( Owsianka et al. , 2001 ; Yagnik et al. , 2000 ) ; 544 - 551 ( Flint et al. , 1999a ; Owsianka et al. , 2001 ) ; et 613 - 618 ( Roccasecca et al. , 2003 ; Yagnik et al. , 2000 ) . Les régions HVR1 et HVR2 pourraient moduler l' accessibilité au site de CD81 ( Roccasecca et al. , 2003 ) et la région localisée entre HVR1 et HVR2 , G436WLAGLFY , serait impliquée dans l' interaction des VHCpp avec CD81 ( Drummer et al. , 2006 ) . Ce motif , présentant des caractéristiques de peptide de fusion de type II , participerait à des étapes pré- et post-interaction avec CD81 et les résidus 437 , 438 , 441 et 442 contribueraient directement au site d' association avec CD81 ( Drummer et al. , 2006 ) . La mutagenèse de E2 dans le contexte des VHCpp a également permis d' identifier les résidus participant à l' interaction de E2 avec CD81 ( 420 , 527 , 529 , 530 et 535 ) ( Owsianka et al. , 2006 ) . Par contre , à l' opposé des résultats obtenus avec la sE 2 , les hétérodimères E1E2 et les VLP , cette étude a montré que la région entre les résidus 474 et 495 ne participe pas directement de l' association entre E2 et CD81 ( Owsianka et al. , 2006 ) . L' importance des résidus Trp 437 -Leu 438 -Leu 441 -Phe 442 et Tyr 527 -Trp 529 -Gly 530 -Asp 535 de E2 et Ile 181 -Ile 182 -Leu 185 -Phe 186 de CD81 pour l' association E2-CD81 indique que l' interaction se fait probablement entre des résidus hydrophobes présents dans les deux molécules ( Drummer et al. , 2006 ; Owsianka et al. , 2006 ) . CD81 et la spécificité d' espèce L' interaction entre E2 et CD81 ne requiert pas d' autres molécules étant donné que l' expression exogène de CD81 humaine dans des lignées de rat est suffisante pour l' attachement de E2 ( Flint et al. , 1999a ) . CD81 de certaines espèces , comme les tamarins et les chimpanzés , est capable d' interagir avec sE 2 ( Allander et al. , 2000 ; Flint et al. , 2006 ; Meola et al. , 2000 ) . Par contre , sE 2 n' interagit pas avec CD81 issue de souris ou de rat ( Allander et al. , 2000 ; Flint et al. , 2006 ) et l' expression de CD81 humaine dans des souris transgéniques ne permet pas l' infection par le VHC ( Masciopinto et al. , 2002 ) . Il a été montré que les VHCpp n' infectent pas non plus les lignées non hépatocytaires non humaines , telles que les cellules CHO d' hamster et les cellules Cos- 7 de singe vert d' Afrique ( Bartosch et al. , 2003c ; Bartosch et al. , 2003d ; Lavillette et al. , 2005b ) , même lorsque les CHO expriment la CD81 humaine ( Bartosch et al. , 2003d ; Evans et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2005b ) . De même , les cellules hépatocytaires murines ne sont pas infectables par les VHCpp , telles que les Hepa 1 - 6 ( Zhang et al. , 2004a ) et les NIH-3T3 exprimant la CD81 humaine ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ) . Les résultats de l' infection des VHCpp sur les cellules hépatocytaires humaines HepG 2 exprimant de manière ectopique la CD81 murine ne sont pas aussi clairs . Tandis que Bertaux & Dragic montrent que ces cellules ne sont pas permissives aux VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ) , les résultats de Flint et collaborateurs indiquent que les HepG 2 exprimant la CD81 murine sont non seulement permissives aux VHCpp , mais également aux VHCcc ( Flint et al. , 2006 ) . Cette dernière étude montre également que l' expression ectopique de CD81 de chimpanzé , de tamarin et de singe vert d' Afrique permet de rendre les HepG 2 permissives aux VHCpp et VHCcc . Les CD81 de rongeurs , souris , rat et hamster permettent l' infection des VHCpp et VHCcc , mais avec des niveaux réduits par rapport à CD81 de primates , suggérant une affinité plus faible entre E2 et CD81 de rongeurs ( Flint et al. , 2006 ) . Ensemble , ces résultats indiquent que CD81 n' est pas le déterminant de la spécificité d' espèces . CD81 et la cinétique de l' entrée virale CD81 semble jouer un rôle après l' attachement des particules virales aux cellules . L' étude de la cinétique de l' infection est possible par l' incubation des virus avec les cellules à 4 °C pendant 1h. Sous ces conditions , l' attachement des virus aux cellules a lieu , mais ils n' entrent pas de manière efficace . L' entrée des particules virales dans les cellules se fait à partir du moment où les cellules sont transférées à 37 °C. Des anticorps anti-CD81 inhibent l' infection des VHCpp et VHCcc lorsqu' ils sont ajoutés pendant l' attachement du virus à 4 °C ou à partir du moment où les cellules sont transférées à 37 °C ( Cormier et al. , 2004b ; Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Morikawa et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . De plus , l' ajout d' anticorps anti-CD81 jusqu'à 1h après le transfert des cellules à 37 °C permet d' inhiber l' infection des VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , la t 1 / 2 des anticorps anti-CD81 pour inhiber l' interaction entre CD81 et les VHCpp et VHCcc est de 17 et 18 minutes , respectivement ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Evans et al. , 2007 ) . Par ailleurs , les anticorps anti-CD81 sont capables d' inhiber 50 % de l' infection des VHCcc lorsqu' il sont ajoutés 1 heure après le transfert des cellules à 37 °C , indiquant que 50 % des particules virales sont déjà entrées dans les cellules après 1h d' incubation à 37 °C ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . Le niveau d' expression de CD81 et l' entrée virale La susceptibilité de cellules à l' infection par le VHC est étroitement liée au niveau d' expression de CD81 à leur surface ( Akazawa et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2007 ) . Koutsoudakis et collaborateurs ont utilisé les cellules hépatocytaires Huh- 7.5 et Huh- 7 -Lunet . Bien que ces cellules soient hautement permissives à la réplication de l' ARN viral des réplicons , elles présentent des niveaux différents d' infection par les VHCcc . En effet , le faible niveau de permissivité des cellules Huh- 7 -Lunet était lié à un niveau insuffisant d' expression de CD81 à la surface cellulaire . Cette étude suggère qu' un seuil d' expression de CD81 doit être limitant pour permettre l' infection par le VHC . Leurs données indiquent que les cellules qui expriment des niveaux indétectables ou faibles de CD81 à la surface sont peu ou pas infectables , tandis qu' à partir d' un certain seuil d' expression de CD81 ( 7 x 104 molécules / cellule ) , la susceptibilité à l' infection augmente rapidement . A partir d' un certain niveau d' expression de CD81 , l' infectiosité n' augmente plus , suggèrant que d' autres facteurs limitent probablement l' infection ( Koutsoudakis et al. , 2007 ) . Une autre étude , réalisée par Akazawa et collaborateurs , a analysé des clones cellulaires individuels issus de la dilution limite de cellules Huh- 7 . D' une manière générale , les clones négatifs pour CD81 étaient également négatifs pour l' infection par les VHCcc ; par contre , les clones positifs pour CD81 présentaient des niveaux différents de permissivité au VHC . Toutefois , l' hétérogenéité des différents clones cellulaires par rapport à la réplication de l' ARN viral , l' infectiosité et l' expression de CD81 suggèrait que d' autre ( s ) facteur ( s ) , en plus de CD81 , participent à la permissivité cellulaire au VHC ( Akazawa et al. , 2007 ) . CD81 , la composition lipidique membranaire et l' entrée virale La teneur en cholestérol de la membrane plasmique est également importante pour l' entrée du VHC ( Kapadia et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2006 ) . Il a été montré que le traitement des cellules avec la methyl- ? -cyclodextrine ( M ? CD ) , une drogue qui extrait le cholestérol membranaire , induit une inhibition de l' infection par le VHC ( Kapadia et al. , 2007 ) . Cette inhibition est directement liée à la diminution de la quantité de CD81 à la surface ( Kapadia et al. , 2007 ) , car CD81 interagit physiquement avec le cholestérol ( Charrin et al. , 2003c ) . De plus , le réapprovisionnement des cellules en cholestérol après leur traitement avec cette drogue permet la restauration de l' infection et des niveaux d' expression de CD81 ( Kapadia et al. , 2007 ) . Curieusement , le traitement des cellules avec la M ? CD augmente l' expression de SR-BI dans les cellules , indiquant que l' importance de cette molécule dans l' infection doit être secondaire par rapport au rôle joué par CD81 , ou alors les niveaux d' expression de surface des deux protéines nécessaires à l' infection pourraient être différents ( Kapadia et al. , 2007 ) . L' expression de CD81 à la surface cellulaire est également régulée par la composition lipidique membranaire . Les sphingolipides sont importants pour l' organisation de la membrane plasmique et ils s' associent avec le cholestérol pour former des microdomaines enrichis en lipides ( lipid rafts ) . La transformation des sphingomyélines en céramides par la sphingomyelinase , enzyme présente à la surface cellulaire , influence l' entrée de certains virus . Pour le VHC , il a été montré que l' enrichissement de la membrane en céramides induit l' internalisation de CD81 , inhibant l' entrée virale ( Voisset et al. , 2007 ) . Les tétraspanines s' organisent à la membrane plasmique dans des microdomaines spécifiques différents des rafts et le cholestérol contribue à l' organisation de ces microdomaines . Les céramides pourraient alors modifier la distribution de ces microdomaines à la surface cellulaire . Le rôle de CD81 dans l' étape d' entrée du VHC Bien que l' implication de CD81 dans le processus d' entrée virale soit clairement établi ( Figure 11 ) , son rôle spécifique n' est pas encore défini . La tétraspanine CD81 pourrait contribuer à la fusion membranaire , puisque cette molécule participe à des evénements de fusion dans la différentiation des myoblastes ( Tachibana and Hemler , 1999 ) et la tétraspanine CD9 joue un rôle important dans la fusion entre les ovocytes et les spermatozoïdes pendant la fertilisation ( Le Naour et al. , 2000 ) . CD81 pourrait également être impliquée dans des voies de signalisation intracellulaire qui seraient responsables de l' induction des mécanismes d' entrée virale . Par ailleurs , l' expression tissulaire de CD81 est presque ubiquitaire , alors que le tropisme du VHC est principalement restreint aux cellules hépatiques . De plus , certaines lignées hépatocytaires exprimant CD81 ne sont pas permissives aux virus ( Bartosch et al. , 2003d ; Cormier et al. , 2004b ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ) . L' ensemble de ces résultats indique que CD81 est une protéine nécessaire , mais pas suffisante pour l' entrée du VHC . Un ou plusieurs facteurs de l' hôte , encore non identifiés , serait ( aient ) indispensable ( s ) pour le déroulement de cette étape du cycle viral . 2.2.2 . Le scavenger récepteur classe B de type I ( SR-BI ) Le SR-BI est une protéine exprimée à la surface de nombreux tissus et types cellulaires , particulièrement dans le foie et les tissus stéroïdogéniques ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds et al. , 2004 ) . Cette protéine traverse deux fois la membrane plasmique , avec les extrémités N- et C-terminales cytoplasmiques et une boucle extracellulaire , présentant neuf sites potentiels de N-glycosylation ( Figure 14 ) ( Rhainds and Brissette , 2004 ) . SR-BI est un récepteur à ligands multiples incluant les LDL acétylées et oxydées et les lipoprotéines de haute densité ( HDL ) ( Acton et al. , 1996 ) . L' incorporation cellulaire des lipoprotéines par SR-BI s' effectue en deux étapes : l' attachement au récepteur et le transfert des lipides ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds and Brissette , 2004 ) . Ainsi , SR-BI intervient dans le métabolisme lipidique de la cellule . En utilisant la forme sE 2 , Scarselli et collaborateurs ont identifié SR-BI comme un récepteur potentiel du VHC ( Scarselli et al. , 2002 ) . Son rôle dans l' infection virale a été demontré par l' utilisation de VHCpp et VHCcc ( Bartosch et al. , 2003c ; Kapadia et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2005b ; Voisset et al. , 2005 ) . Des anticorps anti-SR-BI inhibent l' interaction de sE 2 , des VHCpp et des VHCcc avec SR-BI ( Bartosch et al. , 2003d ; Catanese et al. , 2007 ; Kapadia et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Des anticorps dirigés contre les lipoprotéines spécifiques inhibent également l' interaction entre SR-BI et le virus , mais pas des anticorps dirigés contre les glycoprotéines E1 et E2 ( Maillard et al. , 2006 ) . L' infection en absence de lipoprotéines peut aussi être inhibée par des anti-SR-BI ( Catanese et al. , 2007 ) . Lorsque l' utilisation d' ARN interférents dirigés contre SR-BI permet une réduction efficace de l' expression de SR-BI à la surface des cellules hépatocytaires , l' infection est fortement inhibée ( Lavillette et al. , 2005b ; Voisset et al. , 2005 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Par ailleurs , la surexpression de SR-BI et SR-BII ( une isoforme de SR-BI ) peut augmenter le niveau d' infection de cellules cibles par des VHCcc ( Grove et al. , 2007 ) , et il semblerait que la région HVR1 de E2 soit nécessaire à la reconnaissance de SR-BI ( Barth et al. , 2005 ; Bartosch et al. , 2003c ; Scarselli et al. , 2002 ) . Figure 14 . La structure de la protéine SR-BI . SR-BI est constituée d' une grande boucle extracellulaire , de deux passages transmembranaires avec deux queues cytoplasmiques . La boucle extracellulaire contient neuf sites potentiels de glycosylation ( en vert ) et six cystéines ( en violet ) . SR-BI est palmitoylée au niveau de deux cystéines localisées à l' extrémité C-terminale ( d' après Cocquerel et al. , J. Gen . Virol . 2006 ) . SR-BI est un récepteur des HDL et des LDL acétylées et oxydées . Les LDL oxydées sont capables d' inhiber l' infection des VHCpp et VHCcc ( von Hahn et al. , 2006 ) . Au contraire , les HDL peuvent faciliter l' entrée des VHCpp et VHCcc , de manière dépendante de la capacité de transfert lipidique de SR-BI ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) . Les HDL sont également capables de réduire la neutralisation de l' infection des VHCpp et VHCcc par des anticorps dirigés contre E2 ou des anticorps purifiés à partir de sérum de patients infectés ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Lavillette et al. , 2005a ; Meunier et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2006 ) . L' augmentation de l' infectivité des VHCpp induite par les HDL est dépendante de l' interaction entre la région HVR1 de E2 et SR-BI ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) et les résidus L339 et G406 de cette région semblent être impliqués ( Bartosch et al. , 2005 ) . L' effet stimulateur des HDL se fait par une stimulation de l' activité de transfert lipidique de SR-BI , car des drogues qui réduisent cette capacité de transfert , comme la BLT- 4 , annulent l' effet des HDL sur l' infection des VHCpp et VHCcc ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2006 ) . Cependant , les HDL n' interagissent pas directement avec les particules virales ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) . Les HDL sont formées par des lipides associés à des apolipoprotéines , mais l' utilisation des apolipoprotéines A-I et A-II libres de lipides n' a pas d' effet sur l' infection des VHCpp et des anticorps polyclonaux dirigés contre les apolipoprotéines A-I , A-II , C-II et C-III n' annulent pas l' effet des HDL ( Bartosch et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2005 ) . Inversement , il a été proposé que l' apolipoprotéine C1 serait un des composants responsables de l' interaction des HDL avec les particules virales ( Dreux et al. , 2007 ; Meunier et al. , 2005 ) . Par ailleurs , SR-BI peut également interagir avec l' apolipoprotéine serum amyloïde A ( SAA ) et l' internaliser ( Baranova et al. , 2005 ; Cai et al. , 2005a ) . La SAA est une protéine produite principalement dans le foie après une infection , un dommage tissulaire ou une inflammation ( Uhlar and Whitehead , 1999 ) , suggérant un rôle bénéfique dans la protection de l' hôte . De façon intéressante , la SAA inhibe l' entrée des VHCpp et VHCcc , en interagissant avec les particules virales , en système VHCpp ( Cai et al. , 2007 ; Lavie et al. , 2006 ) . L' ensemble de ces observations confirme l' implication de SR-BI dans l' entrée du VHC ( Figure 11 ) . Cependant , sa présence dans d' autres tissus ne permet pas d' expliquer le tropisme hépatique du virus . D' autre part , il a été montré que l' étape de l' entrée du VHC au cours de laquelle SR-BI interviendrait se produirait après l' attachement du virus aux cellules cibles ( Bartosch et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2005 ) . Récemment , Evans et collaborateurs ont montré que les VHCcc s' associent aux cellules non hépatocytaires CHO exprimant SR-BI , mais non pas aux cellules CHO exprimant CD81 ou la Claudine 1 , suggérant que SR-BI pourrait intervenir avant CD81 dans le processus d' entrée ( Evans et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , il semblerait que la participation de SR-BI et CD81 dans l' entrée virale est intimement liée et a lieu pendant la première heure de l' infection , puisque les temps d' inhibition de l' infection des VHCcc par des anticorps anti-SR-BI et anti-CD81 sont similaires ( Zeisel et al. , 2007 ) . De plus , l' inhibition de l' infection induite par la co-incubation des cellules avec les deux types d' anticorps , en comparaison à des cellules incubées avec ces anticorps séparement , est encore plus importante , suggérant que SR-BI et CD81 coopérent pendant une étape post-attachement de l' entrée du VHC ( Kapadia et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Des anti-CD81 et anti-SR-BI sont également capables d' inhiber l' entrée des VHCpp , toutefois il n' y a pas d' effet coopératif en combinaison des deux , suggérant que la coopération de SR-BI et CD81 observée pour l' inhibition de l' infection des VHCcc se passe probablement pendant une étape post-entrée ( Kapadia et al. , 2007 ) . Cette étude montre que des différences existent entre les mécanismes d' entrée des VHCpp et VHCcc . Jusqu'à présent , aucune interaction directe entre les dimères E1E2 et SR-BI n' a été décrite , suggérant que l' association du VHC avec SR-BI n' est pas directement liée à E2 , mais se fait probablement par les lipoprotéines associées aux virions . Cette molécule étant capable d' internaliser ses ligands , le virus pourrait ainsi exploiter l' activation physiologique de SR-BI par les lipoprotéines pour être endocyté ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds and Brissette , 2004 ) . 2.2.3 . Les molécules des jonctions serrées Claudines Récemment , une banque d' ADNc de cellules hépatiques humaines a été utilisée dans le but de trouver un récepteur spécifique du VHC . Cette approche a permis l' identification d' un nouveau cofacteur nécessaire à l' entrée du virus , la Claudine- 1 , une protéine des jonctions serrées ( Figure 15 ) ( Evans et al. , 2007 ) exprimée principalement dans le foie ( Furuse et al. , 1998 ) . Cet organe exprime également d' autres claudines ( Rahner et al. , 2001 ) . Figure 15 . La structure des Claudines , protéines de jonctions serrées . Les claudines sont constituées de quatre passages transmembranaires , une courte séquence intracellulaire N-terminale , deux domaines extracellulaires ( EL1 et EL2 ) et une queue intracellulaire C-terminale qui peut être phosphorylée et qui permet l' interaction avec d' autres protéines par son motif PDZ . Les jonctions serrées assurent l' étanchéité des épithéliums . Elles constituent un rapprochement étroit et localisé des membranes de deux cellules voisines , limitant le passage des solutés à travers l' espace intercellulaire ( Aijaz et al. , 2006 ; Schneeberger and Lynch , 2004 ) . Les claudines sont les composants les plus importants des jonctions serrées . Ces protéines présentent quatre TMD , deux boucles extra-cellulaires et leurs extrémités N- et C-terminales sont dirigées vers le cytoplasme . Les domaines extracellulaires sont responsables de la perméabilité de la barrière en formation et la queue C-terminale , qui contient un motif PDZ d' interaction avec d' autres protéines , est responsable de l' ancrage au cytosquelette ( Gonzalez-Mariscal et al. , 2003 ; Van Itallie and Anderson , 2006 ) . Ces protéines jouent un rôle crucial dans la régulation de la dynamique des flux paracellulaires et dans la maintenance de la polarité cellulaire ( Gumbiner , 1993 ) . La concentration et le type de claudines d' une jonction serrée dans un type cellulaire donné déterminent la force de la sélection de la barrière . Certaines de ces protéines ont déjà été impliquées dans l' infection par d' autres virus : le récepteur aux coxsackievirus et aux adénovirus ( CAR ) , impliquée dans l' entrée de ces deux virus , et la molécule d' adhésion des jonctions ( JAM ) , importante pour l' infection des réovirus , comme les rotavirus par exemple . Pour le VHC , il a été montré que la Claudine- 1 ( CLDN- 1 ) est exprimée dans différentes lignées d' hépatocarcinome et est nécessaire à l' entrée des VHCpp et VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) ( Figure 11 ) . La réduction de l' expression de CLDN- 1 dans les cellules hépatiques par des ARN interférents entraîne une diminution de l' infection par des VHCpp et VHCcc , mais la surexpression de CLDN- 1 n' augmente pas l' infectiosité ( Evans et al. , 2007 ) . Des anticorps dirigés contre un épitope inséré dans la première boucle extracellulaire de la CLDN- 1 sont également capables de bloquer l' infection par le VHC de façon dose-dépendante ( Evans et al. , 2007 ) . Des cinétiques d' inhibition suggèrent que la CLDN- 1 agit plus d' une heure après la fixation du virus sur les cellules , avec une t 1 / 2 d' inhibition de l' infection par les VHCcc de 73 minutes , indiquant que cette molécule agit après SR-BI et CD81 dans l' entrée virale ( Evans et al. , 2007 ) . De plus , il a été montré que CLDN- 1 s' associe à CD81 et LDL-R à la membrane plasmique et dans le cytoplasme des cellules , et que lorsqu' elle est surexprimée , elle interagit également avec E1 et E2 du VHC ( Harris et al. , 2008 ; Yang et al. , 2008 ) . La CLDN- 1 est capable de s' associer aux tétraspanines CD81 et CD151 , probablement d' une manière indirecte via son interaction avec la tétraspanine CD9 ( Kovalenko et al. , 2007 ) . Par ailleurs , d' autres claudines , comme les CLDN- 6 et - 9 , semblent également être impliquées dans l' infection par le VHC ( Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) . Toutefois , bien que les ARN messagers des CLDN- 6 et - 9 soient présents dans des lignées hépatocytaires et dans les PBMCs ( Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) , aucune expression protéique n' a été détectée dans les lignées hépatocytaires analysées ( Meertens et al. , 2008 ) . De manière intéressante , l' expression de CLDN- 1 dans certaines lignées non-hépatiques , telles que les HEK-293T et SW13 , les rend permissives à l' infection par les VHCpp et VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Yang et al. , 2008 ) et l' expression des CLDN- 1 , - 6 et - 9 présente le même effet pour l' infection par des VHCpp de différents génotypes ( Meertens et al. , 2008 ) . Ainsi , c' est la première fois que l' expression d' une protéine permet de rendre des cellules non-hépatiques permissives au VHC . L' entrée des VHCpp dans les cellules HEK-293T exprimant les CLDN- 1 , - 6 ou - 9 peut être inhibée par du sérum de patient VHC positif , par un anticorps anti-CD81 et par la diminution de l' acidité des endosomes via le traitement des cellules par la bafilomycine A1 ( Meertens et al. , 2008 ) , suggèrant que l' expression des CLDN ne modifie pas l' importance de CD81 et de l' acidification endosomal pour l' infection . La majorité des claudines présente une grande homologie de séquence en acides aminés , spécialement les CLDN- 6 et - 9 , qui différent d' un seul acide aminé . Ces protéines sont phylogénétiquement plus proches des claudines 3 et 4 , et la CLDN- 1 est plus proche de la claudine 7 ( Zheng et al. , 2007 ) . Les homologies de séquences ne peuvent donc pas expliquer la capacité des CLDN- 1 , - 6 et - 9 à conférer l' entrée au VHC , indiquant qu' un motif tridimensionnel ou l' interaction avec d' autres composants cellulaires pourraient permettre l' infection ( Meertens et al. , 2008 ) . Par contre , l' alignement des séquences en acides aminés des CLDN- 3 , - 6 et - 9 humaines ont permis l' identification de quatre résidus pouvant jouer un rôle dans l' entrée virale . Néanmoins , bien que la claudine 3 présente une grande homologie de séquence avec les CLDN- 6 et - 9 , elle n' est pas capable de conférer une sensibilité au VHC dans les cellules HEK-293T. Les études par mutagenèse de ces quatres positions indiquent que les résidus N38 et V45 de la CLDN- 9 sont importants pour l' entrée des VHCpp ( Zheng et al. , 2007 ) . De plus , les positions I32 et E48 , critiques pour l' infection par le VHC dans les cellules qui expriment la CLDN- 1 ( Evans et al. , 2007 ) , sont également importantes pour la CLDN- 9 ( Zheng et al. , 2007 ) . D' autre part , Meertens et collaborateurs ont exprimé les CLDN- 1 , - 6 et - 9 dans deux lignées hépatocytaires , H 1H et NKNT3 . Ces lignées expriment CD81 , mais sont résistantes à l' infection du VHC . L' expression de la CLDN- 1 a permis une infection des VHCpp- 1a et 1b dans ces cellules . Par contre , l' entrée médiée par la CLDN- 6 était faible et détectable uniquement pour le génotype 1a , alors que les cellules exprimant la CLDN- 9 restaient non infectables ( Meertens et al. , 2008 ) . De plus , l' expression exogène des CLDN- 6 et - 9 dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 suivie d' un traitement avec des ARN interférents dirigés contre la CLDN- 1 ne permet pas la restauration de l' infection par des VHCcc et VHCpp ( Meertens et al. , 2008 ) . Ces résultats , liés au fait que certaines lignées cellulaires , comme les cellules HeLa , exprimant la CLDN- 1 ( en plus de CD81 et SR-BI ) demeurent résistantes à l' infection ( Evans et al. , 2007 ) , suggèrent que d' autres facteurs cellulaires modulent la fonction des claudines dans l' entrée du VHC . Le rôle exact des claudines reste donc à élucider . Les hépatocytes sont des cellules hautement polarisées ( Figure 16 ) : le pôle basolatéral , en contact avec les capillaires sinusoïdes , est responsable de la sécretion des protéines du sérum , par exemple , tandis que le pôle apical , en contact avec les canalicules biliaires , est responsable de la sécrétion de la bile . Le VHC entre dans le foie probablement par les capillaires sinusoïdes , accédant d' abord aux pôles basolatéraux des hépatocytes . Les complexes virus-récepteurs pourraient alors migrer de la surface latérale des hépatocytes aux jonctions serrées présentes à la surface apicale de ces cellules , où l' interaction avec les claudines permettrait l' endocytose ( Meertens et al. , 2008 ) . Dans ce sens , plusieurs protéines codées par des pathogènes ont été décrites comme responsables de l' interruption de l' intégrité des jonctions serrées pour faciliter l' accès à l' hôte . L' entérotoxine de Clostridium perfringens dissocie les claudines 3 et 4 des jonctions serrées permettant l' invasion de la bactérie ( Sonoda et al. , 1999 ) ; la protéine CagA d' Helicobacter pylori dissocie les protéines des jonctions serrées et les molécules d' adhésion , induisant des altérations du pôle apical pendant l' entrée de la bactérie dans les cellules ( Amieva et al. , 2003 ) ; et une protéine des adénovirus dissocie l' intégrité des jonctions serrées pendant la sécrétion virale ( Walters et al. , 2002 ) . Figure 16 . Représentation schématique du parenchyme hépatique . Les surfaces baso-latérales des hépatocytes sont en contact avec les capillaires sinusoïdes bordés par des cellules endothéliales fenêtrées et avec les autres hépatocytes , alors que les surfaces apicales sont en contact avec les canalicules biliaires , formés par les parois des hépatocytes et délimités par des jonctions serrées . Dans la lumière des capillaires , il existe des cellules de Kupfer , les macrophages hépatiques , et dans l' espace de Disse , des cellules de Ito , qui stockent des graisses . Certains hépatocytes sont multinuclés . Pour le VHC , une étude récente sur des cellules polarisées d' adénocarcinome colo-réctal Caco- 2 montre que les VHCpp les infectent préferentiellement via la surface apicale en comparaison avec le pôle basolatéral ( Mee et al. , 2008 ) . Par contre , l' expression de CD81 , SR-BI et CLDN- 1 est plus importante à la surface basolatérale des cellules Caco- 2 polarisées ( Mee et al. , 2008 ) . Dans les tissus hépatiques ( normaux ou infectés par le VHC ) , la CLDN- 1 est exprimée , en plus des jonctions serrées , dans les surfaces apicale et basolatérale des hépatocytes et elle colocalise avec CD81 dans ces deux régions ( Harris et al. , 2008 ; Reynolds et al. , 2008 ) . La queue cytoplasmique C-terminale de la CLDN- 1 , ainsi que la palmitoylation ne sont pas nécessaires à l' entrée des VHCpp ( Evans et al. , 2007 ; Harris et al. , 2008 ) . La queue cytoplasmique C-terminale est importante pour la médiation des interactions avec d' autres protéines des jonctions serrées , et la palmitoylation pourrait réguler l' interaction avec d' autres protéines ou diriger la molécule vers des régions spécifiques à la membrane plasmique ( Heiskala et al. , 2001 ; Van Itallie and Anderson , 2006 ) . Ceci indique que la formation des jonctions serrées n' est pas essentielle à l' entrée virale . De plus , la queue cytoplasmique C-terminale de la CLDN- 1 n' est pas nécessaire à son association avec CD81 , suggèrant que la forme de CLDN- 1 qui interagit avec CD81 n' est pas associée à d' autres protéines des jonctions serrées ( Harris et al. , 2008 ) . Dans ce sens , CLDN- 1 s' associe également aux tétraspanines CD9 , CD81 et CD151 en dehors des jonctions serrées ( Kovalenko et al. , 2007 ) . L' ensemble de ces données donnent des indications supplémentaires sur le mécanisme d' entrée du VHC , mais ne permettent pas encore d' expliquer le mécanisme précis de l' entrée du VHC dans les hépatocytes . 2.3 . L' internalisation du VHC Les virus enveloppés peuvent entrer dans leurs cellules cibles selon deux stratégies . Certains , comme le VIH et la plupart des rétrovirus , pénètrent dans le cytoplasme des cellules hôtes en fusionnant directement leur enveloppe avec la membrane plasmique . Ce processus est indépendant du pH et les changements conformationnels des protéines d' enveloppe nécessaires à la fusion sont induits par une interaction directe de ces protéines avec leurs récepteurs . D' autres virus enveloppés entrent dans leurs cellules cibles par endocytose . De façon simplifiée , on distingue quatre voies d' endocytose : la voie dépendante de la clathrine , la voie dépendante des cavéoles , la voie non clathrine / non cavéole et la macropinocytose ( Figure 17 ) ( Pelkmans and Helenius , 2003 ) . La voie d' endocytose dépendante de la clathrine est empruntée , par exemple , par le virus de la forêt de Semliki , les adénovirus ( non-enveloppés ) , le virus influenza et le virus de la stomatite vésiculaire ( Pelkmans and Helenius , 2003 ) . L' exemple type de virus utilisant la voie des cavéoles est le virus simien 40 ( SV40 ) , un virus non-enveloppé ; mais d' autres virus ont été décrits , comme le virus ebola ( Pelkmans and Helenius , 2002 ) . La voie non clathrine / non cavéole pourrait servir au SV40 comme un moyen alternatif d' entrée dans les cellules ( Pelkmans and Helenius , 2003 ) . Enfin , récemment il a été montré que le virus de la vaccine utilise la voie de la macropinocytose ( Mercer and Helenius , 2008 ) . Une fois internalisés , les virus sont dirigés vers les compartiments intracellulaires spécifiques dans lesquels la capside est libérée par fusion des membranes virale et endosomale ou par lyse membranaire . Figure 17 . Voies d' endocytose empruntées par les virus . Les virus exploitent différentes voies d' internalisation . La macropinocytose est un processus d' internalisation induit de façon non-spécifique . Les virus sont endocytés dans une vacuole , appelée macropinosome . La voie dépendante de la clathrine est souvent utilisée par les virus , tels que le VHC . Une cage recouverte de clathrine est formée par invagination de la membrane plasmique et se détache formant les vésicules à manteaux de clathrine . Le VHC et d' autres virus sont ainsi délivrés aux endosomes précoces . La voie d' internalisation par les cavéoles est dépendante de la présence de radeaux lipidiques . Les cavéoles fusionnent ensemble formant le cavéosome et les virus internalisés par cette voie sont transportés jusqu'au RE . Une voie non-clathrine et non-cavéole mais dépendante des radeaux lipidiques est également utilisée par certains virus . La plupart des voies mènent aux endosomes précoces et les virus peuvent alors fusionner dans ce compartiment sous l' influence du pH acide , ou bien accéder à l' endosome tardif , où il va fusionner . L' utilisation d' inhibiteurs de l' acidification des endosomes , tels que la bafilomycine A1 , la concanamycine A , le chlorure d' ammonium ou encore la chloroquine , a permis de montrer que l' entrée des VHCpp ( Bartosch et al. , 2003d ; Hsu et al. , 2003 ; Meertens et al. , 2006 ) et des VHCcc ( Blanchard et al. , 2006 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Tscherne et al. , 2006 ) était dépendante du pH , suggérant que le VHC entre dans ses cellules cibles par endocytose ( Figure 11 ) . D' autre part , la fusion des VHCpp et de liposomes est aussi dépendante du pH , avec un seuil à 6 , 3 et un pH optimum à 5 , 5 ( Lavillette et al. , 2006 ) . De plus , l' utilisation de molécules ou d' ARN interférents ciblant la clathrine a permis de montrer que le VHC entre dans ses cellules hôtes par endocytose dépendante de la clathrine ( Blanchard et al. , 2006 ; Meertens et al. , 2006 ) . Finalement , l' utilisation de mutants dominants négatifs de protéines impliquées dans l' endocytose indique que le VHC fusionne avec les endosomes précoces et non avec les endosomes tardifs ( Meertens et al. , 2006 ) . Pour de nombreux virus enveloppés , le pH acide active un changement conformationnel nécessaire à l' évènement de fusion entre les membranes virale et endosomale . De tels virus sont généralement inactivés par un traitement physique à pH acide . Dans le cas du VHC , ce type de traitement n' a pas d' effet sur l' infectiosité des particules ( Meertens et al. , 2006 ; Tscherne et al. , 2006 ) . Le VHC adopte donc probablement une conformation sensible au pH acide après une ( des ) interaction ( s ) avec son ( ses ) récepteur ( s ) ou co-récepteur ( s ) présent ( s ) à la surface des cellules cibles . Un système de fusion entre les VHCpp et des liposomes a permis de montrer que la fusion était dépendante de la température et ne nécessitait pas la présence de protéines à la surface des liposomes . De plus , elle pourrait être facilitée par la présence de cholestérol ( Lavillette et al. , 2006 ) . Bien que plusieurs études antérieures aient identifié des peptides potentiels de fusion dans la séquence de E1 et de E2 ( Ciccaglione et al. , 2001 ; Drummer et al. , 2007 ; Flint et al. , 1999b ; Garry and Dash , 2003 ; Pacheco et al. , 2006 ; Perez-Berna et al. , 2006 ; Yagnik et al. , 2000 ) , le modèle de Lavillette et collaborateurs a permis de montrer qu' une région de E1 ( résidus 270 & 226;& 128;& 147; 284 ) et deux régions de E2 ( résidus 416 - 430 et 600 - 620 ) participent au mécanisme de fusion du VHC ( Figure 12 ) ( Lavillette et al. , 2007 ) . Les auteurs suggèrent que la région dans la séquence de E1 et la deuxième région dans la séquence de E2 ( 600 - 620 ) seraient responsables des premières étapes de la fusion des membranes , alors que les autres régions pourraient contribuer à la fusion lors d' étapes plus tardives , telles que la déstabilisation de la membrane , la formation du pore et/ou son agrandissement . D' autre part , la mutation de certains résidus des TMD de E1 et E2 altère la propriété de fusion de ces glycoprotéines d' enveloppe ( Ciczora et al. , 2007 ) . L' étude des mécanismes de fusion du VHC avec le modèle des liposomes a permis d' identifier une molécule capable d' inhiber cette étape de l' entrée du VHC , l' arbidol ( Boriskin et al. , 2008 ; Boriskin et al. , 2006 ; Pecheur et al. , 2007 ) . L' arbidol est une molécule antivirale à spectre large largement utilisée en Russie contre l' Influenza et qui est également capable d' inhiber la fusion de plusieurs virus enveloppés et non-enveloppés ( Boriskin et al. , 2008 ) . V. Les tétraspanines et leurs partenaires Les tétraspanines forment une famille de protéines membranaires conservées au cours de l' évolution . Cette famille a été découverte vers la fin des années 80 avec les clonages successifs de CD63 ( Hotta et al. , 1988 ) , CD37 ( Schwartz-Albiez et al. , 1988 ) , CD81 ( Oren et al. , 1990 ) , CD9 ( Boucheix et al. , 1991 ) et CD53 ( Wright et al. , 1993 ) , dont les séquences protéiques possédaient des homologies significatives . Certaines protéines appartenant à cette superfamille sont également exprimées chez les champignons et les invertébrés , tels que la drosophile , les schistosomes et le Caenorhabditis elegans ( Huang et al. , 2005b ) . De plus , des molécules ressemblant aux tétraspanines ont été identifiées chez certains protozoaires et dans des plantes ( Huang et al. , 2005b ) , indiquant qu' elles sont anciennes dans l' évolution . La conservation de l' organisation des gènes codant les tétraspanines suggère fortement que ces molécules dériveraient d' un ancêtre commun par duplication ( Garcia-Espana et al. , 2008 ; Wright et al. , 1993 ) . De multiples tétraspanines sont exprimées dans chaque organisme , par exemple , la drosophile exprime au moins 37 membres de cette famille . Chez l' homme , elles sont au nombre de 33 , dont presque la moitié a été identifiée à partir de banques de séquences EST ( de l' anglais , Expressed sequence tag ) , et une minorité d' entre elles a fait l' objet d' études approfondies ( Figure 18 ) . Les tétraspanines sont des protéines capables d' interagir entre elles et avec d' autres molécules , appelées partenaires , pour former des complexes multimoléculaires à la surface des cellules . Cette caractéristique est importante pour un grand nombre de fonctions exercées par ces protéines . Elles jouent un rôle dans des fonctions aussi diverses que la migration , les interactions intercellulaires , la réponse immunitaire , le développement ou encore la fusion des gamètes . Certaines jouent également un rôle clé dans le processus de cancérisation et certaines pathologies infectieuses , telles que l' hépatite C , comme expliqué précédemment , le paludisme et la diphtérie . Figure 18 . Arbre phylogénétique des tétraspanines de mammifères . ( d' après Boucheix & Rubinstein , Cell . Mol . Life Sci . 2001 ) 1 . La structure des tétraspanines Comme expliqué dans la partie III . 2.2.1 sur CD81 , les tétraspanines sont des protéines de surface cellulaire qui traversent quatre fois la membrane plasmique , avec deux boucles extracellulaires , une petite ( EC1 ou SEL ) et une grande ( EC2 ou LEL ) , et des extrémités N- et C-terminales intracellulaires ( Figure 13A ) . Ses protéines possèdent de 204 à 355 acides aminés ; la petite boucle comprend 20 à 28 acides aminés , tandis que la grande boucle en possède 76 à 131 . Les extrémités cytoplasmiques comprennent , dans la plupart des cas , moins de 19 acides aminés , et le domaine cytoplasmique , présent entre les deuxième et troisième TMD , possède moins de 5 acides aminés . La plupart des tétraspanines sont potentiellement N-glycosylées dans la LEL , à quelques exceptions près , telles que CD9 , qui est glycosylée dans la SEL ( Boucheix et al. , 1991 ) , et CD81 qui n' est pas glycosylée ( Oren et al. , 1990 ) . En général , les sites de glycosylation sont rarement présents dans la SEL et quand ils y sont présents , ils ne semblent pas glycosylés ( Seehafer et al. , 1988 ) . Certaines tétraspanines , comme CD9 , sont acylées ( Seehafer et al. , 1988 ) . Les tétraspanines possèdent également des cystéines dans les régions intracellulaires juxtamembranaires permettant leur palmitoylation ( Berditchevski et al. , 2002 ; Charrin et al. , 2003b ; Charrin et al. , 2002 ; Yang et al. , 2002 ) , une modification post-traductionnelle consistant en l' ajout de palmitates sur des cystéines intracellulaires juxtamembranaires . Chaque région structurale est associée à des fonctions spécifiques des tétraspanines . En général , les domaines extracellulaires , principalement la LEL , sont des médiateurs des interactions spécifiques avec les protéines latéralement associées et avec les ligands connus . Ils présentent d' ailleurs des divergences de séquence plus importantes que les TMD et les domaines intracellulaires ( Stipp et al. , 2003b ) . Les régions cytoplasmiques sont responsables du lien avec les molécules de la voie de signalisation et du cytosquelette . De leur côté , les quatre TMD stabilisent les tétraspanines pendant leur biosynthèse et participent aux associations entre les tétraspanines et d' autres protéines , qui sont cruciales pour l' assemblage et la maintenance du réseau de tétraspanines à la surface cellulaire . Enfin , la palmitoylation des cystéines juxtamembranaires est importante pour la formation des microdomaines à tétraspanines ( Berditchevski et al. , 2002 ; Kovalenko et al. , 2004 ; Yang et al. , 2002 ) . On distingue les membres de cette famille des autres protéines à quatre TMD par leurs caractéristiques communes , telles que la présence de certains résidus conservés ( Levy and Shoham , 2005c ) . Ces caractéristiques seront détaillées par la suite . 1.1 . Les domaines extracellulaires Les domaines extracellulaires présentent une grande variabilité de taille et de séquence . Cependant , le domaine EC2 ou LEL possède des acides aminés hautement conservés , surtout plusieurs cystéines localisées à distance constante des TMD . On retrouve ainsi deux cystéines dans un motif CCG situées à environ 50 acides aminés du troisième TMD . Ces cystéines forment deux ponts disulfures avec deux autres cystéines de EC2 ; une présente dans un motif PXXC ( où X représente n' importe quel acide aminé ) et l' autre située 11 acides aminés en amont du quatrième TMD ( Figure 13A ) . Ces cystéines sont également impliquées dans la conformation du domaine EC2 des tétraspanines . Ces protéines peuvent d' ailleurs être classées en trois groupes en fonction du nombre de ponts disulfures présents dans le domaine EC2 ( Seigneuret et al. , 2001 ) : groupe 1 avec deux ponts disulfures ( CD81 et CD9 ) ; groupe 2 , largement majoritaire , avec trois ponts ( CD82 et CD151 ) ; et groupe 3 avec quatre . Jusqu'à présent aucune analyse cristallographique n' a été faite sur des molécules entières de tétraspanines , du fait de la difficulté d' obtenir des quantités suffisantes de protéines actives , stables et monomériques . Par contre , la structure de la LEL de CD81 a été analysée par diffraction des rayons X après cristallisation , comme expliqué dans la partie III . 2.2.1 sur CD81 ( Figure 13B ) . Récemment , il a finalement été possible de produire de la CD81 humaine entière chez la levure Pichia pastoris , ce qui permettra par le suite l' étude de la structure et de la fonction de CD81 par cristallographie en rayons X et par résonance magnétique nucléaire ( Jamshad et al. , 2008 ) . La modélisation de la structure du domaine EC2 de plusieurs tétraspanines a permis d' obtenir une structure proche de celle observée avec le cristal de CD81 , c' est-à-dire une structure conservée au niveau du « pied » , avec l' insertion d' un domaine variable en taille , en séquence et en structure dans la « coiffe » ( Bienstock and Barrett , 2001 ; Seigneuret et al. , 2001 ) . Ce domaine variable pourrait donner la spécificité à chaque tétraspanine . Dans le cas de CD81 , la région variable présente la plus grande variation de séquence par rapport aux molécules des différentes espèces . Cette région pourrait également contenir le site de fixation de la glycoprotéine E2 du VHC , comme cité précédemment . Dans la même région le motif SFQ de CD9 contribue de manière essentielle à la fusion des gamètes ( Zhu et al. , 2002 ) . De même , la protéine CD151 possède un motif QRD impliqué dans les interactions avec les intégrines ( Kazarov et al. , 2002 ) , qui sont des récepteurs majeurs de la matrice extracellulaire formant des ponts avec le cytosquelette des cellules . Contrairement à EC2 , le rôle de EC1 est mal connu . Dans le cas de CD81 , SEL servirait à maintenir le repliement et la conformation correctes de la LEL , pour une expression optimale de la protéine ou pour assister les protéines associées à être exprimées ( Masciopinto et al. , 2001 ; Yalaoui et al. , 2008 ) . 1.2 . Les domaines transmembranaires Les régions transmembranaires hydrophobes présentent des résidus polaires hautement conservés ( asparagine , acide glutamique et glutamine ) , notamment dans les TMD 1 , 3 et 4 . La présence de tels résidus dans la bicouche lipidique est énergétiquement défavorable , laissant supposer qu' ils participeraient soit à la stabilisation intramoléculaire en interagissant avec des résidus polaires présents dans un des autres TMD voisins , soit à la formation de complexes avec d' autres protéines transmembranaires ( Levy and Shoham , 2005c ) . En effet , il a été montré que les TMD de CD151 seraient plus importants que son EC2 pour établir des contacts entre deux molécules CD151 ( Berditchevski et al. , 2001 ) . D' autre part , la topologie membranaire des TMD serait dépendante de la formation de ponts hydrogènes intramoléculaires entre les résidus polaires ( Seigneuret , 2006 ) . De plus , CD81 présente un motif Gly-X-X-X-Gly dans son premier TMD qui permettrait l' oligomérisation avec des protéines traversant la membrane , par des interactions entre leur régions transmembranaires ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ; Engelman et al. , 2003 ; Russ and Engelman , 2000 ; Shoham et al. , 2006 ) . D' autre part , l' expression en surface des tétraspanines est dépendante de leurs régions transmembranaires . Par exemple , la délétion des TMD2 - 3 ou des TMD4- région cytoplasmique de CD9 empêche l' expression des mutants à la surface des cellules ( Toyo-oka et al. , 1999 ) . De plus , des mutants des régions TMD1 - 2 , TMD2 - 3 et TMD1 - 2-3 de CD151 sont retenus dans le RE ( Berditchevski et al. , 2001 ) . Une autre étude a montré que l' expression de surface d' un mutant de CD82 sans le premier TMD pouvait être restaurée par la co-expression du domaine manquant comme un polypeptide séparé ( Cannon and Cresswell , 2001 ) . En outre , il a été montré que l' interaction entre la LEL de CD81 et le domaine extracellulaire de la protéine CD19 ( Bradbury et al. , 1993 ; Shoham et al. , 2006 ) induit une réponse intracellulaire uniquement lorsque les deuxième et troisième TMD de CD81 sont présents ( Shoham et al. , 2006 ) . Ils seraient nécessaires à la formation d' homodimères de CD81 et contribueraient ainsi à organiser les interactions membranaires permettant son association avec CD19 . De plus , le premier TMD de CD81 est suffisant pour l' expression de CD19 à la surface des cellules ( Shoham et al. , 2006 ) . D' autre part , certaines observations démontrent que les TMD jouent également un rôle dans la stabilisation conformationnelle de la molécule , ainsi que dans la biosynthèse des tétraspanines . Des délétions dans les TMD de CD82 engendrent en effet la rétention de la protéine au sein du RE et le repliement incorrect de EC2 ( Cannon and Cresswell , 2001 ) . 1.3 . Les domaines intracellulaires Les domaines N- et C-terminaux des tétraspanines semblent avoir un rôle clé dans le maintien des interactions entre elles et avec d' autres molécules . Ces domaines pourraient établir des interactions avec le cytosquelette ou avec des protéines de signalisation cellulaire . Ils pourraient également contribuer à définir la localisation cellulaire de ces protéines ( Levy and Shoham , 2005c ; Stipp et al. , 2003b ) . La palmitoylation des cystéines qui jouxtent les TMD serait importante pour ces fonctions . Il a en effet été montré que leur remplacement par des résidus ne pouvant pas être palmitoylés réduisait l' association des tétraspanines CD9 et CD151 avec d' autres protéines de cette famille , comme CD81 ( Berditchevski et al. , 2002 ; Charrin et al. , 2003b ; Charrin et al. , 2002 ; Yang et al. , 2002 ) . En outre , la palmitoylation des cinq résidus cystéines intracellulaires de CD81 est requise pour son association avec un membre de la famille des protéines signal liant les résidus sérine / thréonine , appelé 14 - 3-3 ( Clark et al. , 2004 ) . Cette observation suggère une implication des domaines terminaux de CD81 dans la signalisation cellulaire et montre l' importance de la palmitoylation dans cette fonction . L' état de palmitoylation des tétraspanines joue probablement un rôle dans la distribution subcellulaire et dans les associations latérales des tétraspanines avec leurs protéines partenaires ( Berditchevski et al. , 2002 ; Kovalenko et al. , 2004 ; Yang et al. , 2002 ) . D' autre part , les domaines cytoplasmiques des tétraspanines seraient aussi impliqués dans les interactions avec des protéines du cytosquelette , directement ou par l' intermédiaire de protéines associées . Cela a été montré pour CD82 dans les lymphocytes T , par exemple . L' engagement de CD82 déclenche des altérations importantes de la morphologie cellulaire , des propriétés d' adhésion et de l' association entre CD82 et le cytosquelette ( Lagaudriere-Gesbert et al. , 1998 ; Zhang et al. , 2001 ) . Enfin , certaines tétraspanines , telles que CD63 , CD82 , CD37 , CD151 et Co- 029 , possèdent à leur extrémité C-terminale un site potentiel d' internalisation ( YXX ? , où ? est un acide aminé hydrophobe ) ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ; Stipp et al. , 2003b ) . Ce motif , absent de CD81 , est responsable de l' adressage de la protéine dans les endosomes tardifs et les lysosomes . Enfin , il a été montré que le domaine cytoplasmique N-terminal de CD81 est important pour la glycosylation correcte de son partenaire CD19 durant la maturation dans le Golgi de lymphocytes B ( Shoham et al. , 2003 ; Shoham et al. , 2006 ) . En effet , l' absence de CD81 diminue le niveau d' expression de la forme totalement glycosylée de CD19 , mais pas de la forme sensible à l' enzyme endoglycosidase H ( endo-H ) . La sensibilité à l' endo-H marque les glycoprotéines n' ayant pas atteint l' appareil de Golgi . CD81 servirait de protéine chaperon lors du transport de CD19 vers la membrane cellulaire ( Shoham et al. , 2003 ; Shoham et al. , 2006 ) . 2 . Les microdomaines enrichis en tétraspanines La caractéristique majeure des tétraspanines est leur capacité d' association avec d' autres tétraspanines , mais également avec d' autres molécules pour former des complexes multimoléculaires à la surface des cellules , la toile de tétraspanines ou le tetraspanin web ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ) ( Figure 19A ) . Figure 19 . L' organisation du réseau de tétraspanines à la surface cellulaire selon le détergent utilisé pour lyser les cellules . A ) Dans une solution contenant 1 % de Brij 97 et des ions divalents , le tetraspanin web reste intact . B ) Dans une solution contenant 1 % de Brij 97 additotionné de 2 mM d' EDTA , le tetraspanin web est dissocié mais les complexes primaires restent intacts . C ) Dans une solution contenant 1 % de Triton X-100 additionné ou non d' EDTA , les tetraspanin web et les complexes primaires sont dissociés . Parmi les protéines associées aux tétraspanines , appelées partenaires moléculaires , on retrouve des molécules d' adhésion , dont certaines intégrines ( ? 3 ? 1 , ? 6 ? 1 , ? 4 ? 1 , ? 6 ? 4 et ? IIb ? 3 ) , les protéines EpCAM , CD44 et CD46 , et des molécules de la superfamille des immunoglobulines ( EWI-F , EWI- 2 , EWI- 3 , EWI- 101 , CD19 , MHC I , MHC II et CD4 ) . Des enzymes , des protéines de signalisation ( PKC ? et PKC ? II , protéines G hétérotrimériques et PIK4 ) et des précurseurs de facteurs de croissance ( HB-EGF et TGF ? ) sont également associés aux tétraspanines ( Hemler , 2005 ; Le Naour et al. , 2006 ; Levy and Shoham , 2005b ) . Il est important de noter que le tetraspanin web est cellule- et tissu-spécifique . Ainsi , dans chaque type cellulaire le réseau est composé de différentes tétraspanines associées à différents partenaires , ce qui caractérise les fonctions liées aux tétraspanines spécifiques de chaque type cellulaire . L' étude de la composition de complexes à tétraspanines repose principalement sur les techniques de co-immunoprécipitation et d' analyse par western-blot , après lyse des cellules par différents détergents . Notamment , après lyse des cellules avec des détergents comme le CHAPS , le Brij 58 , le Brij 96 , le Brij 97 et le Brij 98 , le profil de molécules co-immunoprécipitées est identique d' une tétraspanine à l' autre pour un type cellulaire donné . Ces détergents doux préservent les interactions entre les protéines composantes du tetraspanin web de ce type cellulaire ( Rubinstein et al. , 1996 ; Serru et al. , 1999 ) ( Figure 19A ) . Au contraire , les profils obtenus après lyse des cellules par la digitonine et parfois le Triton X-100 ou le NP40 indiquent que ces détergents durs ne permettent plus d' observer les interactions entre les protéines du tetraspanin web ( Serru et al. , 1999 ) ( Figure 19C ) . De plus , l' ajout de EDTA aux détergents doux permet de dissocier les interactions entre les tétraspanines , mais de garder intacts les associations entre les tétraspanines et leurs protéines partenaires ( Charrin et al. , 2002 ) ( Figure 19B ) . Ces complexes , appelés complexes primaires , sont constitués d' une tétraspanine associée à un nombre limité de partenaires . Selon le modèle du tetraspanin web , les interactions tétraspanine / tétraspanine , dites secondaires , permettent l' assemblage des complexes primaires en complexes d' ordre supérieur qui constituent la toile des tétraspanines ( Serru et al. , 1999 ) ( Figure 19A ) . Les interactions secondaires , celles qui se font tard dans la voie de biosynthèse , dans le Golgi ou post-Golgi , ne nécessitent pas le domaine EC2 et sont stabilisées ou promues par la palmitoylation des tétraspanines . La capacité d' association protéique des tétraspanines est importante pour le rôle d' organisateur de larges complexes multimoléculaires formant le tetraspanin web . Les interactions entre les tétraspanines se font au sein d' un environement lipidique particulier . En effet , les tétraspanines colocalisent avec les gangliosides ( Claas et al. , 2001 ; Delaguillaumie et al. , 2004 ; Odintsova et al. , 2003 ) . Notamment , CD9 s' associe directement au ganglioside GM3 ( Ono et al. , 2001 ) et plusieurs tétraspanines , incluant CD9 , CD81 et CD82 , s' associent directement au cholestérol membranaire ( Charrin et al. , 2003c ) . De plus , plusieurs études ont montré que les complexes à tétraspanines sont distribués , au moins en partie , dans les fractions légères , riches en lipides , après centrifugation en gradient de sucrose ( Charrin et al. , 2003b ; Cherukuri et al. , 2004a ; Cherukuri et al. , 2004b ; Claas et al. , 2001 ; Delaguillaumie et al. , 2004 ) . Cette distribution est encore plus importante pour les détergents qui préservent les interactions entre les tétraspanines , suggérant le concept de microdomaines enrichis en tétraspanines ( TEM ) . Ces microdomaines membranaires pourraient se former par l' interaction entre les protéines et les lipides . Il a été d' ailleurs montré que la palmitoylation de protéines peut réguler ce type d' interaction ( Bijlmakers and Marsh , 2003 ) . Les TEM présentent des analogies avec les radeaux lipidiques classiques ( rafts ) par la présence du cholestérol et de gangliosides , ainsi que par leur présence dans les fractions légères en gradient de sucrose . Cependant , les microdomaines à tétraspanines présentent des caractéristiques qui les distinguent des rafts classiques . Ils sont notamment en majeur partie dissociés lors de la lyse en présence de Triton X-100 à 4 °C , alors que les rafts sont typiquement résistants dans ces mêmes conditions ( Charrin et al. , 2003b ; Claas et al. , 2001 ) . Au contraire , l' intégrité des TEM est maintenue en présence de Brij 97 à 37 °C , condition qui dissocie les rafts ( Charrin et al. , 2003b ; Claas et al. , 2001 ) . De plus , des protéines classiquement associées aux rafts , comme les protéines membranaires à ancrage GPI ou la cavéoline , ne sont pas retrouvées dans les TEM ( Berditchevski et al. , 2002 ) . Les mécanismes d' interaction entre tétraspanines ne sont pas complétement caractérisés , mais des progrès importants ont été réalisés ces dernières années . Le cholestérol membranaire , comme expliqué précédemment , participe à l' organisation des TEM en s' associant directement aux tétraspanines ( Charrin et al. , 2003b ) . En effet , la digitonine , qui précipite le cholestérol , est capable de precipiter les TEM . Claas et collaborateurs ont montré que l' ajout de méthyl- ? -cyclodextrine ( M ? CB ) dans le milieu de culture pour extraire le cholestérol membranaire ne modifie pas les interactions entre tétraspanines à la surface des cellules , mais entraîne l' exocytose de vésicules membranaires contenant plusieurs tétraspanines ( Claas et al. , 2001 ) . En revanche , l' ajout de M ? CB au moment de la lyse des cellules par un détergent qui maintient les interactions entre tétraspanines a pour effet de dissocier ces interactions à l' exception de l' interaction entre CD9 et CD81 ( Charrin et al. , 2003c ) . Récemment , Silvie et collaborateurs ont analysé le rôle du cholestérol dans les interactions entre tétraspanines à l' aide d' un anticorps dirigé contre la CD81 murine ( MT 81w ) qui reconnaît cette molécule uniquement lorsqu' elle est associée aux autres tétraspanines ( Figure 20 ) . Les auteurs ont ainsi mis en évidence que l' ajout de M ? CB dans le milieu de culture diminue la reconnaissance du CD81 par cet anticorps sans modifier la quantité globale de CD81 . Le réapprovisionnement des cellules avec du cholestérol inverse cet effet . De plus , l' ajout de cholestérol sans traitement préalable avec de la M ? CB augmente le marquage par cet anticorps , indiquant que le cholestérol est bien impliqué dans la localisation de CD81 dans les complexes à tétraspanines et que le cholestérol est important pour l' organisation des TEM ( Silvie et al. , 2006a ) . Figure 20 . Schéma de reconnaissance de la CD81 murine par les anticorps monoclonaux MT81 et MT 81w . L' anticorps MT81 reconnaît la population globale de la CD81 murine ( mCD 81 ) dans les cellules . A l' inverse , l' anticorps MT 81w ne reconnaît que la population de mCD 81 associée aux tetraspanin web . Une autre caractéristique des tétraspanines qui favorise les interactions entre ces protéines est la palmitoylation , comme cité précédemment . Plusieurs études ont montré que les tétraspanines sont palmitoylées sur plusieurs cystéines ( Berditchevski et al. , 2001 ; Charrin et al. , 2002 ; Levy et al. , 1991 ; Seehafer et al. , 1988 ; Yang et al. , 2002 ) . La palmitoylation est également importante pour la localisation des multimères dans les cellules . En effet , le marquage des cellules avec un anticorps anti-CD9 de faible affinité , le C9BB , qui la reconnaît uniquement lorsqu' elle est associée en homodimères et hétérodimères indique que les multimères de CD9 sont concentrés aux contacts intercellulaires ( Yang et al. , 2006 ) . Par contre , le mutant de CD9 déficient en palmitoylation présente un marquage diffus de cet anticorps à la surface ( Yang et al. , 2006 ) . L' absence de palmitoylation de CD9 semble être favorable à son interaction avec son partenaire EWI- 2 ( Yang et al. , 2006 ) . Deux autres études suggèrent que la palmitoylation de CD81 est un processus dynamique lié à l' activité biologique de la cellule . En effet , la stimulation des lymphocytes B s' accompagne d' une augmentation de la palmitoylation de CD81 ( Cherukuri et al. , 2004a ) et l' association de CD81 avec l' isoforme ? de la protéine 14 - 3-3 n' intervient qu' en cas de stress oxydant qui inhibe la palmitoylation de CD81 ( Clark et al. , 2004 ) . La palmitoylation de CD82 semble également nécessaire à son effet inhibiteur de la migration des cellules PC3 , dérivées d' un cancer de prostate ( Zhou et al. , 2004 ) . Parmi les molécules associées aux tétraspanines , il a été montré que la palmitoylation des intégrines ? 4 est importante pour la localisation du complexe CD151 / ? 6 ? 4 dans les microdomaines , sans être nécessaire à l' interaction directe entre ces deux protéines ( Yang et al. , 2004 ) . Dans ce sens , les intégrines qui s' associent le plus avec les tétraspanines contiennent en général des sites de palmitoylation . Les acides palmitiques peuvent être ajoutés sur les protéines intracellulaires et de membrane par des acyl-transférases , dont les enzymes de la famille DHHC ( Asp-His-His-Cys ) . Malgré l' importance fonctionnelle de la palmitoylation des protéines , seulement quelques cas de participation spécifique de protéines DHHC ont été décrits ( Hayashi et al. , 2005 ; Keller et al. , 2004 ) . Récemment , il a été montré qu' une enzyme de cette famille , la DHHC2 , régule la palmitoylation de CD9 et CD151 , sans affecter la palmitoylation de la sous-unité ? 4 des intégrines ( Sharma et al. , 2008 ) . Comme CD9 et/ou CD151 s' associent avec plusieurs autres tétraspanines , telles que CD37 , CD53 , CD63 , CD81 et CD82 ( Levy et al. , 1998 ; Tachibana et al. , 1997 ) , Sharma et collaborateurs proposent que leurs cystéines seraient également palmitoylées par DHHC2 , grâce à leur proximité dans le tetraspanin web . Enfin , il a été proposé que la structure des TEM repose sur des briques centrales constituées d' homodimères de tétraspanines ( Hemler , 2003 ; Kovalenko et al. , 2004 ) . L' analyse de la structure en trois dimensions du domaine LEL de CD81 a montré qu' il consiste en un dimère ( Kitadokoro et al. , 2001 ) . De plus , l' utilisation de l' anticorps anti-CD9 C 9 BB montre que la quantité de multimères de CD9 varie selon la composition du tetraspanin web . En effet , lorsque CD81 et CD82 sont sur-exprimées , la multimérisation de CD9 est défavorisée , alors que lorsqu' on réduit l' expression de CD81 et CD151 , il reste plus de CD9 libre , qui peut alors se multimériser ( Yang et al. , 2006 ) . Néanmoins , ce modèle de briques centrales de tétraspanines n' est pas encore totalement admis au sein de la communauté scientifique . La structure de ce domaine comporte une interface hydrophobe potentiellement impliquée dans des interactions tétraspanine / tétraspanine , sans que l' on puisse exclure que cette interface soit en fait impliquée dans d' autres types d' interaction in vivo . Une étude récente de modélisation de la molécule CD81 entière a d' ailleurs suggérée que cette interface hydrophobe serait en fait masquée , au moins en partie , par la SEL de CD81 ( Seigneuret , 2006 ) . Il a été mis en évidence , après pontage covalent , que des homodimères CD9 / CD9 , CD81 / CD81 et CD151 / CD151 , ainsi que des hétérodimères CD81 / CD9 , CD9 / CD151 et CD81 / CD151 peuvent être observés dans différents types cellulaires ( Kovalenko et al. , 2004 ) . Dans ce contexte , il est intéressant de noter que les tétraspanines RDS / périphérine et ROM- 1 de la rétine forment des hétérodimères , qui s' assemblent en tétramères et en structures plus complexes ( Goldberg et al. , 1995 ) . Au niveau de l' urothélium , les tétraspanines UPIa et UPIb s' associent avec leurs partenaires respectifs , les uroplakines UPII et UPIII , formant des hétérodimères UPIa / UPII et UPIb / UPIII . Leur association forme des structures symétriques hexagonales contenant chacune six paires d' hétérodimères UPIa / UPII-UPIb / UPIII ( Hu et al. , 2005 ; Min et al. , 2006 ) . Ces structures hexagonales constituent les plaques urothéliales caractéristiques de la surface de l' épithélium vésical ( Figure 21 ) et ne correspondent donc pas au premier modèle proposé . Ces tétraspanines RDS / périphérine , ROM- 1 et les uroplakines , pourraient répresenter des situations extrêmes , où elles auraient complétement perdu leur relation avec le réseau de tétraspanines pour former des tissus avec des fonctions spécialisées ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ) . A l' heure actuelle , on ne sait pas si ce type d' organisation symétrique à la surface des cellules s' applique plus généralement aux autres types de TEM . Figure 21 . Modèle d' assemblage des plaques urothéliales . Des oligomères formés par des uroplakines UPIa et UPIb et leurs partenaires UPII et UPIIIa , représenté à gauche , s' assemblent en crystaux , comme indiqué à droite ( d' après Hu et al. , Mol . Biol . Cell 2005 ) . 2.1 . Les partenaires moléculaires Les interactions entre tétraspanines et leur partenaires moléculaires pour former les complexes primaires sont directes et spécifiques ( Tableau I ) . TétraspaninesPartenairesUPIaUPIIUPIbUPIIICD 9 Pro-HB-EGF EWI-F EWI- 2 EpCAMCD 63H + K + ATPaseCD 81 CD 19 Intégrine ? 4 ? 1 EWI-F EWI- 2 CD 151 Intégrine ? 3 ? 1 Intégrine ? 6 ? 1 Intégrine ? 6 ? 4 Tableau 1 . Partenaires moléculaires connus des tétraspanines . ( UP = uroplakine , HB-EGF = heparin binding EGF-like growth factor ) Les intégrines ? 3 ? 1 et ? 6 ? 1 s' associent directement à CD151 à l' exclusion d' autres tétraspanines ( Serru et al. , 1999 ) . D' autres exemples de complexes primaires sont CD81 / CD19 sur les cellules lymphoïdes B ( Horvath et al. , 1998 ; Shoham et al. , 2006 ) ou encore CD 81 / intégrine ? 4 ? 1 sur les leucocytes ( Serru et al. , 1999 ) . EWI-F et EWI- 2 , deux protéines de la superfamille des immunoglobulines récemment décrites , s' associent seulement aux tétraspanines CD9 et CD81 ( Charrin et al. , 2003a ; Charrin et al. , 2001 ; Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ; Stipp et al. , 2001b ) . Les complexes primaires les mieux caractérisés sont ceux formés par les tétraspanines et les intégrines . En effet , plusieurs types d' intégrines peuvent interagir avec les tétraspanines , particulièrement avec CD151 , et ces interactions ont lieu dans différents types cellulaires ( Berditchevski , 2001 ; Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Berditchevski et al. , 1997 ; Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Hemler et al. , 1996 ; Yanez-Mo et al. , 2001 ) . CD151 présente des associations stables et de haute stoechiométrie avec la majorité des intégrines ? 3 ? 1 dans plusieurs lignées cellulaires et avec la majorité des intégrines ? 6 dans des lignées lymphoïdes ( Hemler , 2005 ; Serru et al. , 1999 ; Yauch et al. , 2000 ) . CD81 est également capable d' interagir avec ? 3 ? 1 et ? 4 ? 1 ( Berditchevski et al. , 1995 ; Berditchevski et al. , 1996 ; Mannion et al. , 1996 ; Stipp and Hemler , 2000 ; Yanez-Mo et al. , 1998 ) et CD9 s' associe aux intégrines ? 3 ? 1 , ? 2 ? 1 et ? 6 ? 4 dans les cellules épithéliales ( Baudoux et al. , 2000 ; Jones et al. , 1996 ; Yanez-Mo et al. , 1998 ) . Par ailleurs , plusieurs études ont identifié des anticorps monoclonaux dirigés contre des tétraspanines dont la reconnaîssance est modulée par les interactions entre les tétraspanines et les intégrines . Par exemple , un anti-CD9 la reconnaît préférentiellement lorsqu' elle est associée aux intégrines ? 1 , particulièrement avec ? 3 ? 1 ( Gutierrez-Lopez et al. , 2003 ) et des anti-CD151 présentent des réactivités variables selon le démasquage / dépliement des épitopes conformationnels reconnus dans les complexes CD 151 / intégrines ( Geary et al. , 2001 ; Serru et al. , 1999 ) . D' autre part , l' association entre CD151 et l' intégrine ? 3 ? 1 peut , par exemple , être capturée par pontage covalent . De plus , la LEL de CD151 et le domaine extracellulaire de cette intégrine sont nécessaires à leur interaction ( Berditchevski et al. , 2001 ; Yauch et al. , 2000 ) , alors que les TMD et/ou les domaines intracellulaires de CD151 seraient responsables de la régulation de la morphologie cellulaire ( Zhang et al. , 2002 ) et de l' association avec des enzymes de signalisation intracellulaire ( Zhang et al. , 2001 ) . CD151 jouerait alors un rôle de lien à travers la membrane plasmique ( Hemler , 1998 ) . Les interactions entre les tétraspanines et leur partenaires auraient lieu tôt dans le processus de biosynthèse , comme par exemple l' assemblage entre CD151 et les intégrines ? 3 ? 1 ( Berditchevski et al. , 2001 ; Kazarov et al. , 2002 ; Shoham et al. , 2006 ; Stipp et al. , 2003a ; Tu et al. , 2002 ; Yauch and Hemler , 2000 ) . Un autre exemple est l' interaction entre les uroplakines UPIa / UPII et UPIb / UPIII , un pré-requis pour leur sortie du RE ( Tu et al. , 2002 ) . A l' exception de la tétraspanine UPIb , les uroplakines ne sont pas capables de sortir du RE sans la formation des complexes hétérodimèriques . Cependant , sans UPIII , UPIb semble ne pas avoir l' information de ciblage vers une région spécifique de la membrane plasmique de l' urothélium polarisé ( Tu et al. , 2002 ) . Un autre exemple de l' importance de l' interaction entre les tétraspanines et les partenaires pour leur expression à la surface cellulaire est CD81 / CD19 dans les lymphocytes B , comme cité précédemment . CD81 est non seulement nécessaire à l' expression de CD19 à la surface ( Maecker and Levy , 1997 ; Miyazaki et al. , 1997 ; Shoham et al. , 2003 ; Shoham et al. , 2006 ; Tsitsikov et al. , 1997 ) , mais elle est également importante pour la maturation de CD19 dans le Golgi ( Shoham et al. , 2006 ) . Plusieurs régions de CD81 , dont la LEL , les TMD et la région cytoplasmique N-terminale , sont importantes dans ces processus et CD81 serait une protéine chaperon lors du transport de CD19 vers la membrane cellulaire ( Bradbury et al. , 1993 ; Shoham et al. , 2003 ; Shoham et al. , 2006 ; Tsitsikov et al. , 1997 ) . Ces données supportent l' hypothèse que le tetraspanin web commence à s' assembler dans le RE , où les tétraspanines interagissent avec leur partenaires formant des complexes primaires . Le réseau serait ensuite formé par l' union d' autres complexes primaires le long de la voie de biosynthèse et/ou à la membrane plasmique ( Berditchevski et al. , 2001 ; Kovalenko et al. , 2004 ; Shoham et al. , 2006 ; Yang et al. , 2004 ) . 2.2 . EWI- 2 et les autres membres de la famille EWI EWI- 2 / PGRL / IGSF8 / CD316 appartient , avec les protéines EWI-F / CD9P-1 / FPRP / CD315 , EWI- 101 / CD101 / V 7 et EWI- 3 / IgSF 3 , à la famille des protéines EWI , classée dans la superfamille des Ig ( Figure 22A ) ( Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ) . Toutes les quatre se situent sur le chromosome humain 1 ( Stipp et al. , 2001a ; Zhang et al. , 2003b ) . La grande homologie de séquence et leur localisation génomique adjacente suggère une évolution à partir d' un ancêtre commun , par duplication génique ( Zhang et al. , 2003b ) . Les protéines EWI présentent en effet une grande similarité de séquence , entre 23 et 35 % , les deux premiers domaines Ig étant les plus proches avec une similarité de 24 à 57 % ( Figure 22B ) . EWI- 3 et EWI- 101 sont plus proches entre elles , comme le sont EWI- 2 et EWI-F ( Stipp et al. , 2001a ) . La caractéristique principale de ces protéines est la présence d' un motif Glu-Trp-Ile ( EWI ) présent dans leur domaine extracellulaire . En plus de cette caractéristique , les ectodomaines de toutes les protéines EWI sont composés exclusivement de domaines Ig de type V , ce qui est rare dans la famille des Ig en général ( Stipp et al. , 2001a ; Zhang et al. , 2003b ) . Ces protéines présentent un large domaine extracellulaire , un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique courte et hautement chargée ( Figure 22A ) . De plus , les deux domaines Ig les plus distaux des protéines EWI sont les régions présentant le plus d' homologie avec les autres protéines de la superfamille des Ig ( Stipp et al. , 2001a ) . Figure 22 . Les protéines partenaires de la famille EWI . A ) Les domaines Ig les plus proches des protéines EWI sont indiqués par des lignes pointillées . B ) Les relations des protéines de cette famille ont été mesurées par le calcul du pourcentage d' identité sur l' alignement de la séquence entière , en gris , ou sur les deux premiers domaines Ig , en noir ( d' après Stipp et al. , JBC 2001 ) . Plus spécifiquement , la protéine EWI- 2 est une protéine présentant un domaine extracellulaire de 552 acides aminés structurés en quatre domaines Ig-like nommés Ig 1 ( le plus distal ) à Ig 4 ( le plus proximal ) ; un TMD de 21 acides aminés et une queue cytoplasmique de 10 acides aminés ( Figure 22A ) ( Charrin et al. , 2003a ; Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ) . La forme mature du polypeptide a une masse moléculaire prédite de 62 kDa , avec 8 kDa aditionnels probablement dûs à la N-glycosylation des trois site potentiels ( NX ( S / T ) ) présents dans le domaine extracellulaire ( Stipp et al. , 2001a ; Zhang et al. , 2003b ) . Ces sites de N-glycosylation se situent dans le premier , le troisième et le quatrième domaines Ig d' EWI- 2 ( Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ) . La principale différence entre EWI- 2 et les autres protéines de la sous-famille EWI vient des domaines extracellulaires . EWI-F , d' environ 120 kDa , possède en effet six domaines Ig avec six sites potentiels de N-glycosylation et une queue cytoplasmique de 27 acides aminés ( Figure 22A ) ( Charrin et al. , 2001 ; Orlicky , 1996 ; Orlicky and Nordeen , 1996 ) . Cette protéine présente également des acides sialiques ( Charrin et al. , 2001 ) et six cystéines palmitoylées ( Charrin et al. , 2002 ) . EWI- 101 quant à elle présente sept domaines extracellulaires avec sept sites potentiels de N-glycosylation et EWI- 3 , huit domaines extracellulaires ( Figure 22A ) . Ces deux dernières possèdent des cystéines C-terminales supplémentaires à l' extrémité du domaine Ig final . Pour cela , elles s' organisent probablement en dimères avec des ponts disulfures entre ces cystéines ( Figure 22A ) ( Gouttefangeas et al. , 1994 ; Stipp et al. , 2001a ) . EWI- 2 et EWI-F s' associent spécifiquement avec les tétraspanines CD9 et CD81 à la surface de différents types cellulaires , notamment les lymphocytes ( Charrin et al. , 2003a ; Charrin et al. , 2001 ; Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ; Stipp et al. , 2001b ) . Ces associations présentent une haute stoichiométrie , avec environ 70 % pour EWI- 2 ( Stipp et al. , 2001a ) et de 70 à 100 % pour EWI-F ( Charrin et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001b ) . La région d' EWI- 2 responsable de son interaction avec ces tétraspanines est probablement présente dans l' extrémité C-terminale de la protéine . En effet , des produits de clivage d' EWI- 2 , d' environ 52 et 43 kDa , retiennent la capacité à s' associer à CD81 , indiquant que les deux domaines Ig distaux ne seraient pas nécessaires pour l' interaction avec CD81 ( Charrin et al. , 2003a ; Kolesnikova et al. , 2004 ; Stipp et al. , 2001a ) . De plus , une protéine chimérique d' EWI- 2 avec la queue cytoplasmique de CD2 n' interagit plus avec CD81 ( Stipp et al. , 2003a ) . Par ailleurs , dans les cellules de leucémie monocytaire U937 déficientes en CD81 , la majorité d' EWI- 2 n' arrive pas à la surface cellulaire . Ceci suggère qu' en absence de CD81 , EWI- 2 reste dans une forme immature , non complètement glycosylée , qui n' atteint pas la surface de la cellule . CD81 interagirait alors avec EWI- 2 relativement tôt dans la voie de biosynthèse , facilitant son transport à la surface cellulaire , où le complexe tétraspanine-partenaire s' associerait aux autres composants du tetraspanin web ( Stipp et al. , 2003a ) . De plus , il a été montré que deux régions différentes de CD9 contribuent indépendemment pour l' interaction avec EWI- 2 et que la combinaison des deux est nécessaire pour un niveau maximal d' interaction . La première région est localisée dans une région qui inclue à peu près quatorze acides aminés du second TMD , la petite séquence cytoplasmique , le troisième TMD et environ six acides aminés de l' EC 2 de CD9 . La deuxième région est localisée dans l' EC 2 , après le motif conservé CCG ( Charrin et al. , 2003a ) . La première région possède seulement 62 % d' identité avec la région correspondante de CD81 et la seconde région a une pauvre similarité structurale et de séquence avec la LEL de CD81 . Ceci suggère que CD81 s' associe avec EWI- 2 probablement d' une autre manière ( Charrin et al. , 2003a ) . De plus , les séquences de CD9 responsables de son interaction avec EWI- 2 ne sont pas responsables de son interaction avec EWI-F. En effet , il a été montré que le domaine EC2 et/ou le quatrième TMD de CD9 étaient responsables de son interaction avec EWI-F ( Charrin et al. , 2001 ) . De plus , la palmitoylation de CD9 ne serait pas nécessaire à son interaction avec EWI-F ( Charrin et al. , 2002 ) . D' autre part , aucune interaction entre EWI- 101 , EWI- 3 et CD9 / CD81 ( Charrin et al. , 2003a ) ou entre EWI-F et CD82 ( Charrin et al. , 2001 ) n' a été montrée . Par contre , les données sur l' interaction entre EWI- 2 et CD82 sont contradictoires . Tandis que Charrin et collaborateurs n' ont pas observé de co-immunoprécipitation entre ces deux protéines ( Charrin et al. , 2003a ) , Zhang et collaborateurs ont montré une telle interaction ( Zhang et al. , 2003b ) . Néanmoins , dans cette dernière étude , la majorité d' EWI- 2 est associée avec CD81 . L' interaction EWI- 2 / CD82 pourrait alors se faire via CD81 . Dans tous les cas , les différences observées dans ces études peuvent venir des lignées cellulaires différentes et/ou de l' utilisation de détergents différents pour lyser les cellules . 2.2.1 . L' expression tissulaire et localisation subcellulaire des protéines EWI L' analyse de l' expression tissulaire d' EWI- 2 a été faite au départ par la détection de l' ARN de cette protéine dans les différents organes ( Clark et al. , 2001 ; Kolesnikova et al. , 2004 ; Stipp et al. , 2001a ; Zhang et al. , 2003b ) . EWI- 2 est particulièrement exprimée dans le cerveau , les reins , le foie , le placenta et les testicules . La majorité de ces mêmes organes exprime l' ARN d' EWI- 2 murine ( Stipp et al. , 2001a ) , qui possède 91 % d' identité et 96 % de similarité de séquence avec EWI- 2 humaine ( Clark et al. , 2001 ; Stipp et al. , 2001a ) . EWI- 2 pourrait donc avoir des fonctions conservées parmi les différentes espèces . Par la suite , des anticorps anti-EWI- 2 ont permis de montrer qu' EWI- 2 est exprimée dans les cellules du sang périphérique , telles que les cellules B , T et NK . Par contre , elle n' a pas été détectée dans les granulocytes et les plaquettes ( Charrin et al. , 2003a ; Vidal-Laliena et al. , 2005 ) . EWI- 2 est également présente dans les cellules dendritiques ( Sala-Valdes et al. , 2006 ) . Ces cellules et les monocytes présentent une stimulation précoce de l' expression d' EWI- 2 , environ 12 heures après leur activation . L' apparition d' EWI- 2 se fait avant l' expression d' autres marqueurs d' activation , qui apparaissent à partir de deux jours seulement ( Kettner et al. , 2007 ) . Par ailleurs , la distribution d' EWI- 2 dans les cellules immunitaires est identique à la distribution de CD81 , mais différente de celle de CD9 , qui est exprimée chez les basophiles , les éosinophiles , les plaquettes et probablement chez les monocytes ( Boucheix et al. , 1985 ) . De plus , EWI- 2 et CD81 sont exprimées et colocalisent dans les hépatocytes humains ( Charrin et al. , 2003a ) . Quelques études ont analysé la localisation tissulaire des autres membres de la sous-famille EWI . EWI-F , par exemple , a été détectée dans les poumons , l' utérus , les ovaires , les adipocytes , les cardiomyocytes , les ostéoclastes , les cellules lutéales , les cellules de Leydig , les cellules glandulaires mammaires , les kératinocytes et les glandes salivaires et dans certaines lignées myéloïdes ( Charrin et al. , 2001 ; Orlicky et al. , 1998 ; Orlicky and Nordeen , 1996 ; Vidal-Laliena et al. , 2005 ) . EWI-F est cependant largement exprimée dans de multiples lignées cancéreuses humaines ( Charrin et al. , 2001 ) . Cette différence d' expression entre les tissus normaux et cancéreux indique d' ailleurs une participation potentielle des protéines EWI dans la malignité . Les deux autres membres de la famille montrent un profil de distribution plus restreint . Il a été rapporté qu' EWI- 101 serait exprimée uniquement dans les poumons et les leucocytes ( Rivas et al. , 1995 ; Ruegg et al. , 1995 ) . EWI- 3 , qui a été très peu étudiée jusqu'à présent , présente un spectre de distribution tissulaire intermédiaire , étant hautement exprimée dans les poumons , les reins et le placenta ( Saupe et al. , 1998 ) . Concernant sa localisation subcellulaire , EWI-F présente un marquage de type RE et trans-Golgi ( Orlicky , 1996 ) et colocalise avec CD9 à la surface des cellules épithéliales et endothéliales ( Singethan et al. , 2008 ) . EWI- 2 , de son côté , colocalise et interagit directement avec les protéines Ezrine , Radixine et Moesine , appelées ERM , dans les uropodes de cellules lymphoïdes . Les ERM , concentrées dans les structures riches en actine , sont impliquées dans les interactions entre la membrane plasmique et le cytosquelette . EWI-F colocalise et s' associe également avec ces protéines dans les surfaces apicales de cellules HeLa ( Sala-Valdes et al. , 2006 ) . Les interactions d' EWI- 2 et d' EWI-F avec les protéines ERM se font via les domaines cytoplasmiques des protéines EWI et le domaine N-terminal des protéines ezrine et moesine . De plus , il a été montré que les ERM seraient nécessaires à la localisation subcellulaire des protéines EWI . En effet , lorsque celles  -ci sont co-transfectées avec un domaine N-terminal de moesin qui n' est pas capable d' interagir avec le cytosquelette , le marquage colocalisé des protéines ERM et EWI est diffus à travers la membrane plasmique . Par contre , l' utilisation d' EWI- 2 avec une queue cytoplasmique tronquée ne modifie pas sa localisation intracellulaire . De manière intéressante , il a été montré que la queue cytoplasmique C-terminale de CD81 interagirait également avec le domaine N-terminal des ERM . En l' absence d' une interaction directe entre EWI- 2 et ERM , cette tétraspanine serait alors responsable de la relocalisation d' EWI- 2 vers les sites riches en ERM ( Sala-Valdes et al. , 2006 ) . 2.2.2 . Les fonctions des protéines EWI Comme CD81 , EWI- 2 pourrait réguler la migration cellulaire . En effet , la surexpression de cette protéine diminue la migration de cellules de carcinome métastatique de la prostate Du 154 sur la fibronectine ou la laminine ( Zhang et al. , 2003b ) . La sur-expression d' EWI- 2 dans des cellules de carcinome épithélial A431 induit une réduction de la réaggrégation et du taux de migration cellulaire en laminine 5 ( Stipp et al. , 2003a ) . De même , la sur-expression d' EWI- 2 dans des cellules de leucémie T humaines MOLT- 4 inhibe leur propagation en VCAM- 1 ( molécule vasculaire d' adhésion cellulaire 1 ) , un substrat de l' intégrine ? 4 ? 1 ( Kolesnikova et al. , 2004 ) . Dans les cellules A431 , l' interaction d' EWI- 2 avec l' intégrine ? 3 ? 1 , un des récepteurs de la laminine 5 , se fait via son association aux tétraspanines CD81 et CD9 ( Stipp et al. , 2003a ) . De manière similaire , EWI- 2 interagit avec l' intégrine ? 4 ? 1 dans les cellules MOLT- 4 , via son association avec CD81 . De plus , dans les cellules MOLT- 4 , la surexpression d' EWI- 2 induit une augmentation de l' association CD81 / ? 4 ? 1 ( Kolesnikova et al. , 2004 ) . De manière importante , les niveaux d' expression des intégrines dans ces deux études n' ont pas été altérés par la surexpression d' EWI- 2 , ni la localisation intracellulaire de l' intégrine ? 3 ? 1 dans les cellules A431 . Par contre , CD81 est re-localisée à la périphérie cellulaire , surtout au niveau des filopodes , zones riches en intégrine ? 3 ? 1 ( Stipp et al. , 2003a ) . Enfin , la queue cytoplasmique d' EWI- 2 n' est pas nécessaire pour la migration des cellules A431 en laminine 5 ( Stipp et al. , 2003a ) , ni des cellules MOLT- 4 en VCAM- 1 ( Kolesnikova et al. , 2004 ) . La protéine chimérique EWI- 2 -CD2 est capable d' interagir avec CD9 et donc avec l' intégrine ? 3 ? 1 , par contre elle n' interagit plus avec CD81 ( Stipp et al. , 2003a ) . Ces études indiquent qu' EWI- 2 régule la migration , probablement via son association avec les tétraspanines et les intégrines . De manière intéressante , la réduction de l' expression d' EWI- 2 par des ARN interférents induit une augmentation de la migration cellulaire , de la migration trans-endothéliale , de la polarisation et de la fréquence des uropodes dans les cellules lymphoïdes ( Sala-Valdes et al. , 2006 ) . De plus , la diminution de l' expression d' EWI- 2 induit la phosphorylation des protéines ERM , qui s' associent aux filaments d' actine dans les microvillosités et d' autres protusions cellulaires . L' association entre les protéines EWI- 2 , EWI-F et ERM pourrait alors être responsable du lien entre les tétraspanines et le cytosquelette intracellulaire . Dans ce sens , il a été montré récemment qu' EWI- 2 et EWI-F sont exprimées à la surface des ovocytes et qu' ils forment des complexes avec CD9 , qui pourraient être importants pour la morphologie , la dynamique et la fonction des microvillosités de ces cellules ( Runge et al. , 2007 ) . La tétraspanine CD9 co-immunoprécipite EWI- 2 aussi dans des lignées tumorales . Il a été montré que , dans certaines lignées très malignes , la co-immunoprécipitation d' EWI- 2 est plus importante que dans d' autres lignées ( Yang et al. , 2006 ) . De plus , le marquage de l' anticorps C9BB , qui reconnaît CD9 principalement lorsqu' elle est organisée en multimères , est réduit lorsqu' EWI- 2 est sur-exprimée , indiquant qu' EWI- 2 pourrait induire une diminution de l' homodimèrisation de CD9 . Ceci pourrait expliquer la diminution d' organisation des jonctions intercellulaires de cellules malignes ( Yang et al. , 2006 ) . Une autre étude récente a identifié EWI- 2 comme un marqueur précoce d' activation des cellules dendritiques ( Kettner et al. , 2007 ) . En effet , Kettner et collaborateurs ont montré que l' expression d' EWI- 2 est induite par la stimulation des récepteurs toll-like ( TLR ) 2 et 4 . A l' aide d' une forme soluble contenant les domaines extracellulaires d' EWI- 2 fusionnés aux domaines constants de la chaîne lourde gamma des Ig humaines ( sEWI- 2 -hIg ) , ils ont ainsi identifié un ligand d' EWI- 2 dans les cellules Jurkat , le gène de HSPA8 variant 1 . Ce gène code une protéine de choc thermique ( HSP ) , également connue sous le nom de hsc 70 ou hsc 73 . Le traitement de cellules Jurkat avec des ARN interférents dirigés contre HSPA8 réduit l' association de la protéine chimérique sEWI- 2 -hIg à ces cellules ( Kettner et al. , 2007 ) . L' association d' EWI- 2 est restreinte à HSPA8 , car les autres HSP testées n' étaient pas reconnues . De plus , l' interaction EWI- 2 -HSPA8 est diminuée en présence d' ATP , qui induit des changements conformationnels dans HSPA8 , ou en présence de chaleur , qui diminue les niveaux de surface des protéines HSP . Enfin , les auteurs ont montré que la migration et la capacité de présentation d' antigènes des cellules dendritiques sont modifiées par l' engagement d' EWI- 2 par HSPA8 ou par un anti-EWI- 2 ( Kettner et al. , 2007 ) . Tandis que HSPA- 8 et EWI- 2 ont un effet suppresseur sur la stimulation d' antigènes , un anticorps anti-EWI- 2 augmente la migration de cellules dendritiques matures uniquement vers la chimiokine SLC / CCL 21 ( Kettner et al. , 2007 ) . De son côté , EWI-F a été identifiée comme une glycoprotéine membranaire des corps jaunes bovins avec des propriétés d' association avec la prostaglandine F2 ? ( Orlicky et al. , 1990 ) . Elle est d' ailleurs capable de s' associer au récepteur de cette prostaglandine chez le rat ( Orlicky and Nordeen , 1996 ) et d' inhiber son association à la prostaglandine F2 ? de manière dose-dépendante , non-compétitive et nécessitant l' expression à la fois du récepteur et d' EWI-F dans la même cellule ( Orlicky , 1996 ) . Cette inhibition se fait par une diminution du nombre de récepteurs , plutôt que par une réduction de son affinité ( Orlicky , 1996 ) . D' autre part , l' expression d' EWI-F dans les cellules pré-adipocytaires de souris 3 T 3 -L1 , répresentatives du métabolisme des graisses , augmente durant la différentiation cellulaire ( Orlicky et al. , 1998 ) . Les cellules non-différenciées n' ont présenté que l' ARNm d' EWI-F , suggérant que son expression serait régulée post-transcriptionnellement . Enfin , l' accumulation d' EWI-F est associée à l' accumulation de GL dans ces cellules ( Orlicky et al. , 1998 ) . Cependant , aucune évidence que cette molécule soit capable de réguler les récepteurs à prostaglandines dans les cellules humaines n' a été apportée jusqu'à présent . Récemment , une étude sur l' identification d' antigènes spécifiques de tumeurs , en utilisant une biliothèque d' anticorps présentés par des phages , a identifié EWI-F dans des cellules tumorales de sein humain SK-BR- 3 ( Goenaga et al. , 2007 ) . Bien qu' aucun effet anti-prolifératif n' ait était observé avec l' utilisation de l' anticorps anti-EWI-F sélectionné , les auteurs ont montré qu' il est rapidement internalisé par les cellules tumorales , ce qui pourrait être utilisé par la suite pour délivrer des nanoparticules à EWI-F. Cette approche pourrait apporter des molécules cytotoxiques spécifiquement aux tumeurs ( Goenaga et al. , 2007 ) . Les fonctions des autres membres de la sous-famille des protéines EWI restent très mal connues . En effet , rien encore n' a été publié sur une fonction possible d' EWI- 3 . Pour EWI- 101 , elle est bien décrite comme un marqueur de surface de cellules immunitaires humaines , telles que les cellules T ( Allez et al. , 2002 ; Anumanthan et al. , 1998 ; Braun et al. , 2003 ; Fernandez et al. , 2007 ; Rivas et al. , 1995 ; Ruegg et al. , 1995 ; Schiavon et al. , 1996 ; Soares et al. , 1997a ; Soares et al. , 1997b ; Soares et al. , 1998 ) , les cellules NK ( Anumanthan et al. , 1998 ; Meyer et al. , 2000 ) , les monocytes ( Kantor et al. , 2007 ) et les cellules dendritiques ( Bagot et al. , 1997a ; Bagot et al. , 1997b ; Bouloc et al. , 2000b ) . La stimulation de EWI- 101 dans les cellules dendritiques inhibe la prolifération de cellules T via la production d' interleukine 10 ( Bouloc et al. , 2000a ) , mais elle joue un rôle dans l' activation de ces cellules ( Bagot et al. , 1997b ) , induisant une inhibition de la production d' interleukine 2 par les cellules T activées ( Soares et al. , 1997b ; Soares et al. , 1998 ) . Des résultats contradictoires existent sur la participation du gène qui code EWI- 101 dans le diabète auto-immun de type 1 chez les souris non-obèses diabétiques ( Maier et al. , 2005 ; Penha-Goncalves et al. , 2003 ; Yamaji et al. , 2005 ) . 3 . L' expression tissulaire et localisation subcellulaire des tétraspanines L' expression tissulaire est variable d' une tétraspanine à l' autre , mais de manière générale il semble que toutes les cellules de l' organisme , à l' exception des spermatozoïdes , expriment plusieurs tétraspanines ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ) . Certaines d' entre elles , comme CD9 , CD63 , CD81 , CD82 et CD151 sont largement exprimées dans l' organisme . En revanche , d' autres ont un spectre d' expression plus restreint . CD53 , par exemple , est un marqueur leucocytaire , alors que CD37 n' est fortement exprimée que sur les cellules lymphoïdes B. D' autres tétraspanines ne sont exprimées qu' au niveau de structures tissulaires spécialisées , comme les uroplakines , constituants des plaques urothéliales , et les protéines RDS / périphérine et ROM- 1 , localisées uniquement dans la rétine . Plus spécifiquement , CD81 est exprimée très tôt pendant l' embryogenèse des mammifères . L' expression de la protéine a été détectée dans des ovocytes de souris et dans des oeufs fertilisés , jusqu'au stade de quatre cellules de développement ( Andria et al. , 1992 ) . CD81 est retrouvée dans à peu près tous les tissus , étant exprimé à la surface des cellules épithéliales , des fibroblastes , des cellules endothéliales et de la plupart des cellules du sang , à l' exception des érythrocytes , des plaquettes , des polynucléaires neutrophiles , ainsi que des spermatozoïdes ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Engel and Tedder , 1994 ; Levy et al. , 1998 ) . De manière similaire , la plupart des lignées cellulaires hématopoïétiques humaines testées expriment CD81 , à l' exception des cellules monocytaires U937 . L' ARNm de CD81 est également présent dans tous les tissus murins testés ( Nagira et al. , 1994 ; Tomlinson and Wright , 1996 ) . Par contre , les niveaux d' expression peuvent varier au sein d' un même tissu sous l' effet de l' activation cellulaire . Dans les tissus lymphoïdes par exemple , CD81 est particulièrement présente dans les centres germinaux de cellules B ( Levy et al. , 1998 ) . Elle est également sur-exprimée dans les éosinophiles des patients infectées avec des parasites helminthes ( Mawhorter et al. , 1996 ) . La plupart des tétraspanines sont exprimées à la surface des cellules , mais certaines , comme CD63 , sont également présentes en quantités importantes dans des compartiments intracellulaires ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Sincock et al. , 1999 ) . Comme cité précédemment , les TMD des tétraspanines sont importants pour leurs expression à la surface cellulaire . Deux études ont d' ailleurs montré que le trafic des tétraspanines du RE vers le Golgi est controlé par la protéine chaperon du RE calnexine ( Cannon and Cresswell , 2001 ; Rubinstein et al. , 1997 ) . Rubinstein et collaborateurs ont ainsi montré que CD9 co-immunoprécipite avec la calnexine et que cette interaction est indépendante de la sous-unité ? 1 des intégrines ( Rubinstein et al. , 1997 ) . L' autre étude a montré que la calnexine , mais pas la calréticuline , interagit avec CD82 ( Cannon and Cresswell , 2001 ) . D' autre part , l' absence , chez la souris , de BAP31 , une protéine chaperon qui forme des complexes avec la calnexine , est associée à des réducions d' expression de CD81 et de CD9 ( Zuppini et al. , 2002 ) . La calnexine et la BAP31 pourraient donc contrôler le transport des tétraspanines à la surface des cellules ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ) . La distribution abondante des tétraspanines dans des vésicules intracellulaires a été demontrée essentiellement par microscopie ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Berditchevski and Odintsova , 2007 ; Sincock et al. , 1999 ) . La tétraspanine la mieux étudiée par rapport au trafic intracellulaire est CD63 , identifié comme un marqueur des endosomes tardifs et des lysosomes , où elle se trouve souvent dans les membranes internes . Le motif de ciblage ( GYEVM ) vers les lysosomes présent dans son domaine cytoplasmique C-terminal interagit avec les complexes de protéines adaptatrices , liant alors le trafic de CD63 aux voies dépendantes de la clathrine ( Rous et al. , 2002 ) . Cependant , cette interaction avec les protéines adaptatrices semble cellule-spécifique , puisque l' adressage de CD63 aux lysosomes dans des fibroblastes de souris est indépendant de ce motif , suggèrant qu' une ( des ) voie ( s ) alternative ( s ) existe ( ent ) ( Rous et al. , 2002 ) . Dans ce sens , une étude récente a montré que CD63 interagit avec la synténine- 1 , une protéine qui contient un domaine PDZ et qui est connue pour réguler le transport intracellulaire de ses protéines partenaires ( Latysheva et al. , 2006 ) . En plus de CD63 , d' autres tétraspanines , incluant CD37 , CD82 , CD151 , Tspan- 1 , Tspan- 3 , Tspan- 6 , Tspan- 7 et Co- 029 , possèdent également le motif potentiel d' internalisation ( YXX ? ) au niveau de leur extrémité C-terminale ( Stipp et al. , 2003b ) . Notamment , CD37 , CD82 et CD151 sont dirigées vers les endosomes ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ) . Ce motif est localisé , dans la plupart des cas , dans une région très proche du quatrième TMD , ce qui pourrait empêcher l' interaction avec les sous-unités des complexes de protéines adaptatrices ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ) . Par contre , la suppression de ce motif dans CD151 entraîne une perte de la capacité des cellules à migrer sur la laminine , probablement due à la diminution de l' internalisation des intégrines ( Liu et al. , 2007 ) . Plusieurs tétraspanines s' accumulent dans des corps multivésiculaires qui fusionnent avec la membrane plasmique pour libérer , dans le milieu extracellulaire , des vésicules de 50 à 100 nm , appelées exosomes ( Escola et al. , 1998 ; Raposo et al. , 1996 ) . Les exosomes produits par de nombreux types cellulaires présentent des tétraspanines ( Abache et al. , 2007 ; Morelli et al. , 2004 ) . L' activation des cellules T Jurkat , par exemple , cause une diminution des niveaux de CD81 en surface , mais en parallèle induit la libération d' exosomes présentant de la CD81 et qui vont la transférer à la surface de cellules négatives pour cette tétraspanine ( Fritzsching et al. , 2002 ) . Les exosomes pourraient alors fonctionner comme des vésicules de communication intercellulaire . L' expression de certaines tétraspanines , comme CD81 , qui ne possèdent pas de motif d' internalisation dans des vésicules cellulaires , comme les corps multivésiculaires et les exosomes , pourrait s' expliquer par la présence de ce motif dans environ 10 autres membres de la famille et par leurs tendance à s' associer entre elles ( Berditchevski and Odintsova , 2007 ) . 4 . La fonction des tétraspanines Les tétraspanines sont impliquées dans divers processus biologiques comme l' adhérence , la migration ou la fusion des cellules ; dans des phénomènes de costimulation , de transduction de signal ou encore de différenciation . Leur fonction à l' échelle moléculaire reste toutefois spéculative ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Hemler , 2003 ; Levy and Shoham , 2005c ) . Différentes approches ont été utilisées pour analyser la fonction des tétraspanines , notamment l' utilisation d' anticorps anti-tétraspanines , la surexpression par transfection et leur dépletion par ARN interférence ou l' inactivation de gènes ( knockout ) chez la souris . Souvent identiques d' une tétraspanine à l' autre , ces effets concernent en particulier l' adhérence homotypique ( Masellis-Smith et al. , 1990 ) , l' inhibition de la migration cellulaire ( Cajot et al. , 1997 ; Jones et al. , 1996 ; Lagaudriere-Gesbert et al. , 1997 ; Miyake et al. , 1991 ; Radford et al. , 1997 ; Rubinstein et al. , 1994 ; Stipp and Hemler , 2000 ; Yanez-Mo et al. , 1998 ) , des effets antiprolifératifs ( Oren et al. , 1990 ) ou de costimulation ( Lagaudriere-Gesbert et al. , 1997 ) . L' invalidation chez la souris du gène de plusieurs tétraspanines a révélé leur rôle dans l' activation des cellules du système immunitaire ( Knobeloch et al. , 2000 ; Maecker and Levy , 1997 ; Miyazaki et al. , 1997 ; Tarrant et al. , 2002 ; Tsitsikov et al. , 1997 ; van Spriel et al. , 2004 ; Wright et al. , 2004 ) . Il est cependant difficile de distinguer si ces réponses physiologiques sont issues de l' action directe de la tétraspanine concernée ou des propriétés des partenaires qui lui sont associés . Pour ces raisons , le rôle individuel des tétraspanines reste assez mal connu . CD81 faisant l' objet de mon sujet de thèse , sa fonction dans différents processus est plus amplement développée . Les tétraspanines ont également été impliquées dans différentes pathologies . Des mutations dans certaines tétraspanines ont été associées à des maladies génétiques , comme certaines formes de rétinite pigmentaire ( Kohl et al. , 1997 ) et certains cas de déficit mental lié au chromosome X ( Zemni et al. , 2000 ) . Néanmoins , les mécanismes qui régulent ces maladies sont très peu connus . Par contre , il est bien décrit qu' un grand nombre de mutations dans les gènes des tétraspanines RDS / périphérine et ROM- 1 est associé à des dystrophies rétiniennes . La plupart de ces mutations ponctuelles changent le domaine EC2 , mais elle peuvent aussi changer d' autres régions de ces deux molécules ( Kohl et al. , 1997 ) . Un chapitre décrivant l' implication des tétraspanines dans différentes pathologies d' origine infectieuse est développé plus largement par la suite . 4.1 . Les ligands des tétraspanines S' il est clairement documenté que les tétraspanines s' associent latéralement avec diverses protéines membranaires , il existe par contre peu de ligands connus pour interagir avec les tétraspanines . L' exemple le mieux caractérisé est l' interaction de la glycoprotéine E2 de l' enveloppe du VHC avec CD81 . Un autre exemple de ligand est la glycoprotéine soluble spécifique de la grossesse PSG17 , une protéine produite par le placenta et appartenant à la superfamille des Ig . Chez la souris , mais pas chez l' homme , PSG17 interagit spécifiquement avec CD9 et inhibe la fusion des gamètes . Le site SFQ de CD9 est nécessaire à la fixation de PSG17 ( Ellerman et al. , 2003 ; Waterhouse et al. , 2002 ) . Par ailleurs , il a été montré que l' IL- 16 est aussi un ligand potentiel de CD9 ( Qi et al. , 2006 ) . Cependant , CD9 pourrait potentialiser la fixation de l' IL- 16 sur les cellules , en modulant la conformation et/ou l' activité du récepteur de l' IL- 16 , d' une manière analogue à l' effet qu' exerce CD9 sur la fixation de la toxine diphtérique sur le pro-HB-EGF ( Iwamoto et al. , 1994 ) . Récemment , un ligand pour la tétraspanine CD63 a été identifié par le test du double hybride . Ce ligand est le facteur soluble TIMP- 1 , qui fait partie de la famille des protéines inhibitrices des métalloprotéases de la matrice extracellulaire . A ce titre , TIMP- 1 est donc directement impliqué dans la régulation du renouvellement des protéines de la matrice extracellulaire mais également dans la régulation de la prolifération , la survie cellulaire et la différentiation . En outre , cette étude montre que l' expression de CD63 est nécessaire à l' effet anti-apoptotique et à la polarisation cellulaire induits par la surexpression de la protéine TIMP- 1 ( Jung et al. , 2006 ) . Enfin , un premier ligand membranaire de tétraspanine a également été identifié récemment . Il s' agit du récepteur DARC de chemokines , présente à la surface des cellules endothéliales et qui interagit avec CD82 ( Bandyopadhyay et al. , 2006 ) . En fait , les cellules cancéreuses exprimant la CD82 se lient aux cellules endothéliales via l' interaction de CD82 avec DARC . Cette interaction entraîne une inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses , ainsi que des signaux de sénescence . De plus , la capacité de CD82 à être un suppresseur de tumeur est fortement diminuée dans les souris déficientes pour DARC , indiquant que cette protéine est essentielle dans ce mécanisme ( Bandyopadhyay et al. , 2006 ) . 4.2 . L' influence des tétraspanines dans les fonctions de leurs partenaires Les tétraspanines contribuent à réguler la fonction de leurs partenaires de plusieurs façons . Tout d' abord , elles peuvent jouer un rôle dans le trafic intracellulaire ou extracellulaire de ces molécules associées . Comme expliqué précédemment , CD81 est nécessaire à l' expression de son partenaire CD19 à la surface des lymphocytes B ( Maecker and Levy , 1997 ; Miyazaki et al. , 1997 ; Shoham et al. , 2003 ; Shoham et al. , 2006 ; Tsitsikov et al. , 1997 ) . Par ailleurs , la tétraspanine CD63 s' associe à la sous-unité ? de la pompe Sodium-proton ( H + K + ATPase ) , qui est responsable de l' acidité gastrique . Cette interaction permet l' internalisation de la pompe dans les cellules pariétales de l' estomac et sa redistribution vers des vésicules intracellulaires ( Duffield et al. , 2003 ) . Un autre exemple vient de la surexpression de CD82 dans les cellules épithéliales , qui induit de manière indirecte une augmentation de l' internalisation des ligands du récepteur du facteur de croissance épidermique ( EGF ) , avec lequel CD82 s' associe ( Odintsova et al. , 2000 ) . La tétraspanine CD9 est , quand à elle , associée aux formes précurseurs de certains ligands du récepteur de l' EGF , comme le pro-TGF- ? ( facteur ? de croissance de tumeur ) , le pro-HB-EGF ( facteur de croissance épidermique lié à l' héparine ) et la pro-amphiréguline . L' association de CD9 augmente l' activité de ces ligands dans les phénomènes de signalisation juxtacrine ( Higashiyama et al. , 1995 ; Shi et al. , 2000 ) . CD9 s' associe également avec une métalloprotéase , ADAM10 , capable de cliver certains précurseurs de facteurs de croissance associés à cette tétraspanine ( Yan et al. , 2002 ) . Dans plusieurs types cellulaires , il a été montré que les complexes entre les tétraspanines et les intégrines ? 1 sont fonctionnellement relevants , jouant un rôle dans la régulation de la migration et de l' adhésion cellulaire ( Berditchevski , 2001 ; Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Hemler , 2001 ) . Par exemple , l' expression ectopique de CD9 dans une lignée de cellules B augmente la migration dépendante de l' intégrine ? 1 , accompagnée d' une augmentation de l' activation des protéines tyrosine kinases ( Shaw et al. , 1995 ) . Le pontage covalent de CD81 à la surface de cellules B humaines induit une adhésion dépendante de l' intégrine ? 4 ? 1 ( Behr and Schriever , 1995 ) . Des anticorps monoclonaux dirigés contre CD151 ou contre ? 3 ? 1 peuvent inhiber la migration des neutrophiles in vitro ( Yauch et al. , 1998 ) , et CD151 excerce une influence majeure sur la morphogenèse dépendante de l' intégrine ? 6 ? 1 des fibroblastes et des cellules endothéliales ( Zhang et al. , 2002 ) . Un autre mécanisme de régulation exercé par les tétraspanines est la potentialisation des interactions de leurs partenaires moléculaires avec leurs ligands . Le premier exemple connu est celui du CD9 , qui augmente non seulement l' activité juxtacrine du pro-HB-EGF ( Higashiyama et al. , 1995 ) , mais rend aussi possible la fixation de la toxine diphtérique sur son récepteur , la forme membranaire du pro-HB-EGF ( Iwamoto et al. , 1994 ) . Cette activité est spécifique de CD9 , puisqu' elle n' est pas observée avec d' autres tétraspanines , telles que CD63 , CD81 CD 82 , auxquelles pro-HB-EGF est probablement indirectement associé via CD9 ( Nakamura et al. , 2000 ) . Un autre exemple est la modulation des fonctions des intégrines , particulièrement par CD151 qui s' associe aux intégrines ? 3 ? 1 , ? 6 ? 1 , ? 6 ? 4 et ? 7 ? 1 . Les tétraspanines peuvent soit induire des changements dans la liaison des intégrines à leur ligands , soit induire des modifications au niveau du trafic des intégrines ou soit induire des modifications des voies de signalisation . Ainsi , il a été montré que les tétraspanines facilitent l' interaction des intégrines avec leur ( s ) ligand ( s ) ( Feigelson et al. , 2003 ; Lammerding et al. , 2003 ) et stabilisent leurs conformations sous forme active ( Nishiuchi et al. , 2005 ) . L' inhibition de l' expression de CD151 réduit la migration cellulaire dépendante des intégrines ( Kazarov et al. , 2002 ; Stipp and Hemler , 2000 ; Zhang et al. , 2002 ) et la motilité et l' adhésion des cellules sur le substrat de ces intégrines , sans modifier leur niveau d' expression ( Winterwood et al. , 2006 ) . De plus , l' association à CD151 stabilise la conformation active de l' intégrine ? 3 ? 1 ( Nishiuchi et al. , 2005 ) ; et l' association à CD81 facilite l' adhérence des cellules leucocytaires sur VCAM- 1 , en augmentant l' avidité de l' interaction de l' intégrine ? 4 ? 1 pour ce substrat ( Feigelson et al. , 2003 ) . Enfin , les tétraspanines peuvent réguler des phénomènes de transduction de signaux intracellulaires en aval de leurs molécules partenaires . Les récepteurs couplés au protéines G sont régulés dynamiquement par CD9 et CD81 dans les cellules humaines ( Little et al. , 2004 ) . Ces tétraspanines sont également capables d' activer des voies de signalisation intracellulaires , telles que ERK / MAPK , et sont associées à l' apoptose , via l' activation de la caspase 3 ( Cai et al. , 1997 ; Carloni et al. , 2004 ; Kolch et al. , 1993 ; Murayama et al. , 2004 ) . Un autre exemple est la phosphatidylinositol 4- kinase ( PI4K ) , une enzyme régulatrice de l' architecture du cytosquelette , qui interagit avec CD63 , CD81 ( Berditchevski et al. , 1997 ) et CD151 ( Yauch et al. , 1998 ) . Les tétraspanines peuvent également moduler la signalisation en aval de récepteurs de facteurs de croissance . En effet , il a été montré que la surexpression de CD82 entraine une diminution de l' activation de la signalisation induite par le récepteur de l' EGF ( Odintsova et al. , 2000 ) , ainsi que celui de l' HGF ( Takahashi et al. , 2007 ) . Ces protéines peuvent aussi participer à la signalisation induite par les intégrines , agissant comme des « adaptateurs » entre les intégrines et les molécules de signalisation ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Berditchevski et al. , 1997 ; Zhang et al. , 2001 ) . Ainsi , il a été montré que la surexpression de CD151 diminue l' activation de Ras dans les fibroblastes de rat en réponse à l' adhérence médiée par les intégrines ( Sawada et al. , 2003 ) , et que la sur-expression de CD82 augmente l' expression des protéines FAK et Lyn ( Zhang et al. , 2003a ) . Des anticorps anti-tétraspanines modulent la phosphorylation de la protéine FAK , la principale kinase activée dans la signalisation des intégrines ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ) . L' activation des protéines kinase C ( PKC ) ? et ? II , qui jouent un rôle dans l' adhésion médiée par les intégrines , induit leur translocation à la membrane et leur association aux tétraspanines CD9 , CD53 , CD81 , CD82 et CD151 ( Zhang et al. , 2001 ) . Il est connu que la PKC peut également réguler l' actine ( Keenan and Kelleher , 1998 ) et que l' actine s' associe avec CD9 et CD82 ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Delaguillaumie et al. , 2004 ) . Ces interactions pourraient alors jouer un rôle dans l' adhésion dépendante des intégrines ( Hemler , 2005 ) . Les tétraspanines sont également impliquées dans la migration cellulaire . En effet , plusieurs approches utilisées afin d' identifier des molécules de surface contrôlant la migration de cellules tumorales en culture ont détecté des tétraspanines ( Cajot et al. , 1997 ; Feigelson et al. , 2003 ; Jones et al. , 1996 ; Lagaudriere-Gesbert et al. , 1997 ; Miyake et al. , 1991 ; Rubinstein et al. , 1994 ; Winterwood et al. , 2006 ; Yanez-Mo et al. , 1998 ) . Cependant , les mécanismes par lesquels ces protéines interviennent dans la migration cellulaire ne sont pas connus . Ils sont probablement à mettre en relation avec l' existence de complexes tétraspanine / intégrine . CD151 est la principale tétraspanine à interagir avec les intégrines , présentant une haute stoechiométrie d' association avec ? 3 ? 1 , ? 6 ? 1 , ? 6 ? 4 et ? 7 ? 1 ( Hemler , 2005 ) . Les tétraspanines , principalement CD151 , sont capables de moduler de plusieurs façons les fonctions des intégrines ( la migration , l' adhésion et la motilité cellulaire ) , comme expliqué précédemment . 4.3 . Tétraspanines et remaniements membranaires Plusieurs tétraspanines jouent un rôle dans les processus impliquant des phénomènes de remaniement membranaire . L' exemple le plus marquant est le rôle de CD9 dans la fusion des gamètes . En effet , l' invalidation du gène de CD9 induit une réduction majeure de la fertilité chez les souris femelles sans autre anomalie évidente ( Kaji et al. , 2002 ; Le Naour et al. , 2000 ; Miyado et al. , 2000 ) . Cette infertilité est due à un défaut de fusion des ovocytes avec les spermatozoïdes . Les ovocytes de ces souris présentent des anomalies des microvillosités , région où le spermatozoïde fusionne ( Runge et al. , 2007 ) . De plus , des anticorps anti-CD9 bloquent la fécondation in vitro des ovocytes normaux ( Le Naour et al. , 2000 ) et CD9 est hautement exprimée à la membrane des microvillosités des ovocytes ( Runge et al. , 2007 ) . Il a été d' ailleurs montré que certains anticorps anti-CD9 induisent la formation de microvillosités dans les régions de contact entre les cellules épithéliales et endothéliales ( Singethan et al. , 2008 ) . Par ailleurs , un motif SQF présent dans la région variable du domaine EC2 de CD9 est nécessaire lors de la fusion des gamètes ( Zhu et al. , 2002 ) . De plus , une forme recombinante du domaine EC2 de CD9 est capable de bloquer la fusion quand elle est incubée avec les ovocytes qui expriment CD9 , mais pas avec les spermatozoïdes . Ceci suggère que CD9 n' interagit pas avec un ligand présent au niveau des spermatozoïdes , mais intervient plutôt au cours de la fusion des gamètes en modulant l' activité d' une molécule partenaire sur l' ovocyte ( Zhu and Evans , 2002 ) . De plus , sur l' ovocyte , CD9 contrôle la formation de complexes contenant CD151 et l' un de ses partenaires , l' intégrine ? 6 ? 1 . Ce complexe primaire semble impliqué dans la fusion avec le spermatozoïde puisqu' un anticorps anti-CD151 bloque partiellement ce mécanisme ( Ziyyat et al. , 2006 ) . CD81 est également exprimée par les ovocytes et est aussi impliquée dans la fusion des gamètes . L' invalidation du gène de CD81 entraîne également une réduction de la fertilité chez les souris femelles , liée à un défaut de fusion des gamètes ( Deng et al. , 2000 ; Rubinstein et al. , 2006 ) . Des anticorps anti-CD81 ainsi que le domaine LEL peuvent partiellement inhiber le processus de fusion ( Higginbottom et al. , 2003 ; Takahashi et al. , 2001 ) . L' invalidation du gène de CD9 chez la souris ne supprime pas complètement la fertilité des femelles alors que les souris doublement déficientes en CD9 et en CD81 sont totalement stériles ( Rubinstein et al. , 2006 ) . Puisque les fonctions d' une tétraspanine ne peuvent pas être totalement remplacées par celles de l' autre , CD9 et CD81 participeraient chacune à des étapes propres et probablement complémentaires dans le processus de fusion des gamètes . CD9 et/ou CD81 pourrait ( aient ) interagir avec une ( ou des ) molécule ( s ) responsable ( s ) de l' interaction entre les gamètes ou de la fusion des membranes . Cette interaction serait à l' origine de la modification acrosomique du spermatozoïde qui lui permet de fusionner ( Tanigawa et al. , 2008 ) . D' autres phénomènes de remaniements membranaires impliquent les tétraspanines : CD81 et CD9 jouent un rôle dans la fusion des myoblastes au cours de la différenciation musculaire ( Tachibana and Hemler , 1999 ) ; CD9 participe à la différenciation des mégacaryocytes humains ( Clay et al. , 2001 ) et à la fusion pendant l' ostéoclastogenèse ( Ishii et al. , 2006 ; Takeda et al. , 2003 ) . L' engagement de CD82 , en plus d' amplifier les signaux d' activation du récepteur de cellules T ( TCR ) , induit l' adhérence , l' étalement et le développement d' extensions membranaires des lymphocytes T. Ceci par un mécanisme impliquant la polymérisation de l' actine et des Rho GTPases ( Delaguillaumie et al. , 2002 ; Lagaudriere-Gesbert et al. , 1998 ) . Par ailleurs , les tétraspanines sont également présentes dans les corps multivésiculaires et les exosomes , comme mentionné précédemment ( Escola et al. , 1998 ) . L' ensemble de ces observations suggèrent que les TEM pourraient constituer un environnement particulièrement favorable aux processus impliquant des remaniements membranaires y compris la fusion . 4.4 . Tétraspanines et système immunitaire Le rôle des tétraspanines dans le système immunitaire a été essentiellement abordé par l' utilisation d' anticorps monoclonaux et par des expériences d' invalidation de gènes chez la souris ( Levy and Shoham , 2005c ) . Les souris déficientes en CD37 , une tétraspanine d' expression restreinte aux leucocytes , ont uniquement un défaut des réponses B dépendantes de l' activation des lymphocytes T ( Knobeloch et al. , 2000 ) , probablement dû au rôle régulateur de CD37 dans la prolifération des cellules T ( van Spriel et al. , 2004 ) . Une augmentation de la prolifération des lymphocytes T a été mise en évidence en l' absence de la tétraspanine Tssc 6 ( Tarrant et al. , 2002 ) . La hyperprolifération des lymphocytes T a également été observée dans les souris déficientes en CD151 ( Wright et al. , 2004 ) . CD9 est également exprimée sur les lymphocytes T , ainsi que sur les cellules pré-B. Cependant , les souris dont le gène de CD9 a été invalidé ne présentent pas d' anomalies évidentes des organes lymphoïdes , du système immunitaire ( Boucheix et al. , 1985 ; Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Shaw et al. , 1995 ) , de la réponse humorale , ni du développement des cellules B périphériques ( Cariappa et al. , 2005 ) . A l' origine CD81 a été identifié en tant que cible , à la surface des lymphocytes B , d' un anticorps antiprolifératif ( 5A6 ) ( Oren et al. , 1990 ) . Il a pu être constaté depuis que CD81 est très largement distribué dans les tissus humains et impliqué dans un nombre considérable de réponses physiologiques ( Levy et al. , 1998 ) . Son rôle le mieux caractérisé est celui dans les cellules immunitaires . En effet , différentes études de l' invalidation du gène de CD81 montrent que les souris sont normales et possèdent une maturation normale de toutes les cellules lymphoïdes ( Maecker and Levy , 1997 ; Miyazaki et al. , 1997 ; Tsitsikov et al. , 1997 ) . Cependant , la prolifération in vitro des lymphocytes T , en réponse à différents stimuli , est augmentée en l' absence de CD81 . Les souris déficientes pour CD81 présentent un défaut dans la réponse antigènique de type Th 2 ( Deng et al. , 2002 ; Maecker et al. , 1998 ) et une hyper-réactivité induite par des allergènes ( Deng et al. , 2000 ) . De plus , les cellules B expriment des niveaux bas de CD19 ( Maecker and Levy , 1997 ) . Ces résultats suggèrent que CD81 n' est pas essentiel pour le développement des souris , ni pour leur système immunitaire . Il est possible que d' autres tétraspanines soient recrutées pour compenser l' absence de l' expression de CD81 . Néanmoins , le bas niveau d' expression de CD19 et les problèmes dans les réponse immunitaires humorales suggèrent que les fonctions de CD81 ne puissent pas être complétement substituée par d' autres protéines ( Levy et al. , 1998 ) . A la surface des lymphocytes B , CD81 forme un complexe d' activation lymphocytaire par son interaction directe avec CD19 , une molécule de signalisation . Ce complexe contient également les protéines CD21 , un récepteur du complément , et Leu 13 , un antigène inductible par l' IFN . La fixation de l' antigène sur le récepteur des lymphocytes B ( BCR ) entraîne sa co-ligation au complexe CD 19 / CD 21 / CD 81 / Leu 13 , via la fixation du complément ( présent sur l' antigène ) sur la protéine CD21 ( Dempsey and Fearon , 1996 ) . Cette co-ligation a pour conséquence d' augmenter la signalisation induite par l' activation du récepteur , en diminuant le seuil de réponse à l' antigène ( Tedder et al. , 1994 ) . L' engagement du BCR avec le complexe CD 19 / CD 21 / CD 81 / Leu 13 est accompagné d' une augmentation de l' incorporation de palmitates par CD81 , qui est nécessaire à la relocalisation du BCR dans les microdomaines résistants aux détergents ( Cherukuri et al. , 2004a ) . Les complexes BCR-CD81 / CD19 associés à ces microdomaines activent des voies de signalisation intracellulaire , ceci étant caractérisé par la phosphorylation de résidus tyrosine de nombreuses protéines ( Cherukuri et al. , 2004b ) . L' engagement du BCR au sein du complexe CD 19 / CD 21 / CD 81 / Leu 13 par la glycoprotéine E2 du VHC pourrait le super activer , causant la prolifération de cellules B et même le lymphome non-Hodgkin de cellules B chez les individus infectés ( Levy et al. , 1998 ; Rosa et al. , 2005 ) . Par ailleurs , dans les lymphocytes B , CD81 est également retrouvé en association avec des molécules de MHC II ( Schick and Levy , 1993 ) . Les corps multivésiculaires enrichis en MHC II présentent non seulement CD81 , mais également d' autres tétraspanines , telles que CD37 , CD53 , CD63 et CD82 ( Kropshofer et al. , 2002 ) . De plus , CD81 , comme plusieurs tétraspanines d' ailleurs , est une molécule co-stimulatrice à la surface de cellules T , jouant un rôle dans l' activation des lymphocytes T ( Lagaudriere-Gesbert et al. , 1997 ) . Chez la souris , CD81 est exprimée dans toutes les cellules B et cellules T activées ( Maecker et al. , 2000 ) . Par ailleurs , comme pour les cellules B , le co-engagement de CD81 avec le complexe antigène-récepteur induit l' activation des cellules T ( Witherden et al. , 2000 ) . L' association de CD81 , à la fois avec des molécules sur les lymphocytes T , telles que CD4 et CD8 , et avec un sous ensemble de molécules MHC II sur les cellules présentatrices d' antigènes , peut également affecter la prolifération des lymphocytes T et leur polarisation ( Kropshofer et al. , 2002 ; Levy et al. , 1998 ) . Enfin , la relocalisation de CD81 dans les régions de synapse immunologique , entre les cellules T et B , et entre les cellules T et les cellules présentatrices d' antigènes , suppose un rôle important dans la collaboration entre ces cellules ( Mittelbrunn et al. , 2002 ) . 4.5 . Tétraspanines et autres systèmes Les tétraspanines CD9 , CD151 et CD63 sont fortement exprimées sur les plaquettes ( Boucheix et al. , 1983 ; Fitter et al. , 1995 ; Hotta et al. , 1988 ; Rubinstein et al. , 1993 ) . Plusieurs études ont rapporté l' association entre CD9 et l' intégrine ? IIb ? 3 à la surface des plaquettes et dans les pseudopodes ( Brisson et al. , 1997 ; Indig et al. , 1997 ; Slupsky et al. , 1989 ) . L' étude des souris déficientes pour CD151 a mis en évidence son rôle dans l' agrégation plaquettaire et la rétractation du caillot , activités induites suite à l' activation de l' intégrine ? IIb ? 3 ( Lau et al. , 2004 ) . Par ailleurs , l' activation des plaquettes entraîne la relocalisation de CD63 à la surface où elle s' associe avec CD9 et l' intégrine ? IIb ? 3 ( Hamamoto et al. , 1994 ; Israels et al. , 2001 ) . CD63 pourrait participer à la signalistion induite par l' activation de cette intégrine ( Israels and McMillan-Ward , 2005 ) . Par ailleurs , plusieurs tétraspanines sont exprimées dans le système nerveux ( Banerjee et al. , 1997 ; Bronstein et al. , 2000 ; Stipp and Hemler , 2000 ) . CD9 , Tspan- 2 , Tspan- 3 sont exprimées sur les gaines de myélines ( Bronstein et al. , 2000 ) et Tspan- 5 est exprimée dans les structures corticales du cerveau ( Garcia-Frigola et al. , 2000 ) . Leur importance physiologique dans le cerveau est suggérée par les effets des anticorps anti-CD81 , anti-CD9 et anti-CD151 sur la croissance des neurites ( Schmidt et al. , 1996 ; Stipp and Hemler , 2000 ) . L' expression de CD81 est fortement augmentée sur les astrocytes et les cellules de la microglie après lésion de la moelle épinière chez le rat ( Dijkstra et al. , 2000 ) . De plus , les souris déficientes pour CD81 présentent une augmentation de la taille du cerveau accompagnée d' une augmentation du nombre d' astrocytes et de cellules de la microglie ( Geisert et al. , 2002 ) . La prolifération de ces cellules pourrait être régulée par l' engagement de CD81 au niveau des contacts entre les cellules ( Kelic et al. , 2001 ) . 4.6 . Tétraspanines et cancer Les tétraspanines sont aussi impliquées dans différentes pathologies . De nombreuses études cliniques sur le cancer montrent un lien entre le niveau d' expression de certaines tétraspanines et la formation des métastases tumorales ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ) , le plus souvent en tant que suppresseurs ( Dong et al. , 1995 ; Ikeyama et al. , 1993 ; Radford et al. , 1995 ) , mais parfois aussi en tant que promoteurs ( Claas et al. , 1998 ) . En effet , dans les cancers du sein , du poumon , du colon , de la prostate et du pancréas , un niveau d' expression élevé de CD9 ou de CD82 sur les cellules tumorales est associé à un pronostique favorable . A l' inverse , une diminution de leur expression est souvent corrélée avec l' apparition de métastases dans ces cancers ( Adachi et al. , 1998 ; Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Huang et al. , 1998 ; Maurer et al. , 1999 ; Miyake et al. , 1999 ) . Dans les cancers du poumon et du sein , la réduction simultanée de l' expression de CD9 et de CD82 présente un plus grand potentiel métastatique et un taux de survie plus bas que lorsque l' expression de seulement une des deux tétraspanines est réduite ( Adachi et al. , 1998 ; Huang et al. , 1998 ) . CD63 est également fortement exprimée dans les stages initiaux des mélanomes , tandis que son expression est réprimée dans les stages avancés de la maladie ( Hotta et al. , 1988 ) . Il y a cependant quelques exceptions . La surexpression de CD151 dans les cancers du poumon , du colon et de la prostate est corrélée avec un mauvais pronostique ( Ang et al. , 2004 ; Hashida et al. , 2003 ; Tokuhara et al. , 2001 ) . De même , l' induction de l' expression de Co- 029 est observée , chez le rat , dans des lignées cellulaires de carcinome de colon et de pancréas , qui présentent un plus grand potentiel métastatique ( Claas et al. , 1998 ) . En résumé , les expériences in vitro et in vivo ont montré que CD82 et CD9 sont des suppresseurs de métastases tandis que CD151 et Co- 029 augmentent le potentiel métastatique ( Claas et al. , 1998 ; Gesierich et al. , 2006 ; Takeda et al. , 2007 ) . Les mécanismes qui entraînent le développement et la progression des cancers font intervenir la migration cellulaire , avec notamment un rôle prépondérant des intégrines . Cependant , en tenant compte de la multitude de molécules associées aux tétraspanines , la façon dont elles contrôlent la progression tumorale pourrait ne pas être limitée à leur association avec les intégrines . Dans ce sens , les facteurs de croissance possèdent également un rôle important dans la croissance et la prolifération des cellules cancéreuses . Puisque les tétraspanines modulent ces différents mécanismes , elles pourraient ainsi jouer un rôle prépondèrant dans le cancer . 5 . Les tétraspanines et pathologies d' origine infectieuse Les tétraspanines sont impliquées dans l' action de la toxine diphtérique , comme décrit précédemment , mais aussi dans l' infection par différents pathogènes . En plus de la participation de CD81 dans l' entrée du VHC , d' autres tétraspanines jouent des rôles dans les infections par d' autres virus , tels que le VIH et le virus de la leucémie humaine de cellules T ( HTLV ) . D' autre part , CD81 participe au cycle du parasite Plasmodium , responsable du paludisme . Enfin , une étude a montré un lien entre CD9 et PrP dans le cerveau de souris infectées avec l' agent de l' encéphalopathie spongiforme transmissible . Dans cette étude , des analyses par immunohistochimie ont démontré une stimulation de l' expression de CD9 , spécialement dans les astrocytes , chez l' homme et dans le modèle de la souris ( Doh-ura et al. , 2000 ) . Des études reposant notamment sur l' utilisation d' anticorps anti-tétraspanines ont permis de mettre en évidence le rôle de celles  -ci au cours d' infections par des virus . CD9 , par exemple , a été impliquée dans la susceptibilité à l' infection par le virus de l' immunodéficience féline ( VIF ) ( Willett et al. , 1997 ) . En effet , des anticorps anti-CD9 inhibent la production de virions du VIF ( Hosie et al. , 1993 ; Willett et al. , 1994 ) , par un mécanisme agissant après l' entrée du virus ( de Parseval et al. , 1997 ; Willett et al. , 1997 ) . Ces anticorps inhibent également l' infection par le virus de la maladie de Carré ( CDV , de l' anglais canine distemper virus ) , un morbillivirus qui infecte les canidés ( Loffler et al. , 1997 ) . Dans ce cas , l' inhibition se fait au niveau de la fusion cellule-cellule , induite normalement par ce virus , bloquant la secrétion de particules virales ( Schmid et al. , 2000 ) . Plus spécifiquement , il a été montré récemment que les protéines virales restent distantes du contact entre les cellules , ce qui permet d' expliquer l' absence de fusion et de diffusion virale à travers les cellules ( Singethan et al. , 2008 ) . Par ailleurs , les protéines d' enveloppe et la protéine de matrice du HTLV- 1 sont associées à CD82 ( Mazurov et al. , 2006 ; Pique et al. , 2000 ) . Des anticorps anti-CD81 , anti-CD82 et la surexpression de CD82 avec les glycoprotéines d' enveloppe du HTLV- 1 inhibent la formation de syncytium induite par ce virus . Ceci résulte en une inhibition de la transmission du virus de cellule à cellule ( Fukudome et al. , 1992 ; Imai et al. , 1992 ; Imai and Yoshie , 1993 ; Pique et al. , 2000 ) . D' autre part , la protéine de matrice de ce virus colocalise et co-immunoprécipite avec CD82 , suggérant une association avec les TEM , qui pourraient être impliquée dans la transmission des virions ( Mazurov et al. , 2006 ) . Récemment , il a été montré que le domaine intracellulaire , entre les troisième et quatrième TMD , et la palmitoylation des cystéines juxtamembranaires sont importants pour l' interaction de CD82 avec la protéine de matrice de HTLV- 1 ( Mazurov et al. , 2007 ) . 5.1 . Tétraspanines et VIH Des études ont également établi un lien entre le VIH- 1 et les tétraspanines . Le cycle de ce virus est représenté dans la Figure 23 . Figure 23 . Représentation schématique du cycle viral du VIH . CD63 est une des protéines cellulaires incorporées dans les virions du VIH ( Chertova et al. , 2006 ; Meerloo et al. , 1993 ; Pelchen-Matthews et al. , 2003 ) . Cependant , les virions possédant moins de CD63 sont plus infectieux . De plus , les tétraspanines CD63 , CD9 , CD81 et CD82 incorporées sur les virions ont le potentiel d' atténuer l' infection du VIH de manière souche-spécifique et à une étape post-attachement ( Sato et al. , 2008 ) ( Figure 24 ) . Figure 24 . Représentation schématique de la particule virale du VIH . Il a été montré que , dans les macrophages , des anticorps anti-CD63 inhibent l' infection par le VIH , dans une étape après la fusion du virus ( von Lindern et al. , 2003 ) . Dans ces cellules , à l' inverse des autres types cellulaires , le VIH ne semble pas bourgeonner à la membrane plasmique . En effet , les virions de VIH s' accumulent et probablement s' assemblent dans des endosomes tardifs , enrichis en CD63 , avant de fusionner à la membrane plasmique ( Deneka et al. , 2007 ; Pelchen-Matthews et al. , 2003 ) . Plus spécifiquement , CD63 est recruté dans des compartiments intracellulaires riches en tétraspanines CD81 , CD9 et CD53 pendant l' assemblage viral ( Figure 25 ) . Dans les cellules qui n' expriment pas de CD63 , le virus s' assemble dans le même compartiment intracellulaire riche en CD81 , CD9 et CD53 ( Ruiz-Mateos et al. , 2008 ) . Ce compartiment cellulaire est différent des lysosomes et des endosomes précoces et tardifs ( Deneka et al. , 2007 ) . De plus , l' infection de macrophages par le VIH est inhibé par des protéines recombinantes exprimant les domaines EC2 des tétraspanines CD9 , CD63 , CD81 et CD151 , suggérant que les TEM participeraient à l' infection plutôt que des tétraspanines individuelles ( Ho et al. , 2006 ) ( Figure 25 ) . Toutefois , très récemment il a été montré que le traitement de macrophages avec des ARN interférents dirigés contre CD63 ne modifie ni l' infection , ni la production de nouvelles particules virales , ni l' infectiosité des virus produits dans ces cellules . La redondance et le chevauchement fonctionnel des tétraspanines pourraient jouer un rôle dans l' assemblage du VIH dans les macrophages . Figure 25 . Résumé de la participation des tétraspanines dans l' infection des macrophages par le VIH . Les cellules dendritiques sont capables de capturer le VIH et de le transférer aux cellules T CD 4 + ( Figure 26 ) . De manière équivalente à ce qui a été montré pour les macrophages , après l' internalisation par les cellules dendritiques , le virus se localise dans des compartiments légèrement acides ( pH 6 , 2 ) riches en tétraspanines , telles que CD81 , CD82 , CD9 et partiellement CD63 ( Garcia et al. , 2008 ; Garcia et al. , 2005 ) . Lors du contact avec les cellules T CD 4 + non infectées , le virus présent dans les cellules dendritiques colocalise avec CD81 au site de contact entre les cellules , appelé synapse virologique ( Figure 26 ) . En effet , le virus stimule la redistribution de CD81 et CD9 vers les régions de contact , suggérant que le VIH serait capable d' exploiter la voie responsable de la livraison des composants qui participent à la formation de la synapse immunologique et de l' activation des cellules T , pour faciliter son transfert aux cellules T CD 4 + ( Garcia et al. , 2008 ; Garcia et al. , 2005 ) . Dans ce sens , il a été montré récemment que dans des cellules HeLa transfectées avec la séquence complète du VIH , l' anti-CD9 C 9 BB induit l' aggrégation de différentes tétraspanines ( CD9 , CD81 , CD82 et CD63 ) et de protéines virales ( capside et enveloppe ) aux sites de contact entre les cellules . Ce processus inhibe la sécrétion de particules virales , probablement parce qu' il restreint le bourgeonnement aux sites de contact intercellulaires ( Khurana et al. , 2007 ) . Figure 26 . Résumé de la participation des tétraspanines dans l' infection de cellules dendritiques par le VIH . Dans les cellules T , la protéine de capside du VIH colocalise avec CD9 , CD81 , CD82 et CD63 à la surface de la membrane plasmique ( Booth et al. , 2006 ; Nydegger et al. , 2006 ) . Ce microdomaine , dépendant d' actine , serait utilisé par le VIH pour permettre l' assemblage , le bourgeonnement et le transfert de nouveaux virus d' un lymphocyte à un autre ( Jolly and Sattentau , 2007 ) ( Figure 27 ) . De manière similaire à l' infection des macrophages par le VIH , décrite précédemment , dans les cellules T infectées , CD63 relocalise vers des régions riches en CD81 , où ces deux marqueurs colocalisent avec les protéines de capside et de l' enveloppe virale ( Jolly and Sattentau , 2007 ) . Par ailleurs , il a été montré que la distribution de CD81 à la membrane plasmique varie selon la présence du virus ( Gordon-Alonso et al. , 2006 ) . Ainsi , de manière similaire à ce qui a été montré sur les synapses virologiques des cellules dendritiques , Gordon-Alonso et collaborateurs ont montré que lorsque des cellules T naïves sont incubées avec des cellules T exprimant la protéine d' enveloppe du VIH , CD81 et CD9 s' accumulent aux régions de contact intercellulaire , où se passe la fusion . De manière intéressante , à l' inverse de ce qui se passe avec le CDV , le FIV et le HTLV , des anticorps anti-CD81 et anti-CD9 augmentent la formation de syncytium et la production virale ( Figure 27 ) . De même , des ARN interférents contre ces tétraspanines augmentent la formation de syncytium entre les cellules T naïves et celles qui expriment la protéine de l' enveloppe virale , alors que la surexpression de CD81 et de CD9 induit une diminution du nombre de syncytia ( Gordon-Alonso et al. , 2006 ) ( Figure 27 ) . L' association entre CD81 et CD4 ( Imai et al. , 1995 ; Imai and Yoshie , 1993 ) pourrait expliquer ces résultats . En effet , dans les conditions qui diminuent l' expression de CD81 , un plus grand nombre de molécules de CD4 seraient libres pour s' associer aux protéines virales qui induisent la fusion membranaire ( Gordon-Alonso et al. , 2006 ) . De plus , CD81 associé à CD4 participe à des phénomènes de co-stimulation des cellules T , qui augmentent la transcription et la production virale du VIH ( Tardif and Tremblay , 2005 ) . Figure 27 . Résumé de la participation des tétraspanines dans l' infection de lymphocytes T par le VIH . 5.2 . Tétraspanines et infections bactériennes Comme décrit précédemment , CD9 pourrait aussi participer à la pathogénie de la diphtérie . CD9 est associée au précurseur du facteur de croissance HB-EGF , le pro-HB-EGF , et HB-EGF est le récepteur de la toxine diphtérique sous ses formes soluble ou membranaire ( Hooper and Eidels , 1995 ; Mitamura et al. , 1995 ) . L' expression de CD9 à la surface de cellules exprimant le pro-HB-EGF entraîne une augmentation du nombre de sites d' interaction avec la toxine diphtérique , alors que le nombre de molécules HB-EGF reste constant et l' affinité n' est pas modifiée ( Iwamoto et al. , 1994 ) . L' interaction de la toxine avec le précurseur membranaire lui permet d' être internalisée par la cellule et d' exercer ainsi son effet toxique ( Naglich et al. , 1992 ) . A l' inverse , la forme soluble d' HB-EGF piège la toxine , la rendant inactive ( Hooper and Eidels , 1995 ) , ayant pour conséquence l' inhibition de l' activité de l' HB-EGF en tant que facteur de croissance ( Mitamura et al. , 1995 ) . Il est donc possible que CD9 modifie la conformation du pro-HB-EGF , en démasquant de nouveaux sites de fixation pour la toxine , ou en concentrant ce récepteur au sein des TEM , permettant ainsi des interactions de forte avidité avec la toxine diphtérique . D' autre part , il a été montré que CD63 se localise dans la membrane des bactéries Chlamydia Trachomatis ( Beatty , 2006 ) . Ces bactéries sont des parasites intracellulaires obligatoires qui se multiplient dans des organites membranaires , appelés inclusions . Cette étude a montré que CD63 est présente dans les inclusions , en association avec les membranes bactériennes . De plus , des anticorps anti-CD63 induisent une diminution de la taille des inclusions et une réduction de la descendance infectieuse des Chlamydia ( Beatty , 2006 ) . Ce travail suggère que CD63 joue un rôle dans la biogenèse et la maturation des inclusions bactériennes . 5.3 . Tétraspanines et Plasmodium Le rôle de CD81 a également été mis en évidence dans l' infection par l' agent responsable du paludisme , les parasites du genre Plasmodium . Le paludisme est la maladie parasitaire la plus fréquente au monde ; environ 40 % de la population mondiale est exposée au parasite et l' OMS estime qu' il existe de 350 à 500 millions de cas par an ( infections nouvelles ou ré-infections ) , dont presque 80 % en Afrique subsaharienne ( Greenwood et al. , 2005 ) . Cette maladie tue chaque année entre 1 , 5 et 2 , 7 millions de personnes ( OMS , World Malaria Report 2005 ) . Chez l' hôte vertébré , le cycle de Plasmodium passe par deux stades invasifs successifs , les stades sporozoïte et mérozoïte , qui infectent respectivement les hépatocytes et les érythrocytes ( Figures 28 et 29 ) . Les sporozoïtes , transmis à l' hôte lors d' une piqûre par un moustique femelle du genre Anopheles , passent dans la circulation sanguine et sont rapidement séquestrés au niveau du foie en quelques minutes ( Figure 28 ) . Deux protéines parasitaires de surface , la protéine circumsporozoïte ( CSP ) et la protéine anonyme associée à la thrombospondine ( TRAP ) interagissent avec les GAG des capillaires sinusoïdes hépatiques ( Pradel et al. , 2002 ) . Les sporozoïtes traversent ensuite l' espace de Disse et pénètrent activement dans les hépatocytes , par invagination de la membrane plasmique aboutissant à la formation d' une vacuole parasitophore ( Figure 29 ) . Figure 28 . Le cycle de vie de Plasmodium falciparum . Lors de la piqûre d' un moustique femelle du genre Anopheles contaminé , des sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine de l' hôte . Ils gagnent le foie et infectent les hépatocytes , où ils se différencient en schizontes hépatiques . Après de nombreuses divisions nucléaires , les schizontes matures libèrent dans la circulation sanguine des mérozoïtes , qui infectent les globules rouges , où chacun se multiplie pour libérer de nouveaux mérozoïtes , qui à leur tour infectent des globules rouges . Ce cycle de multiplication érythrocytaire est responsable de la symptomatologie . Certains mérozoïtes se différencient en formes sexuées , les gamétocytes , qui peuvent être ingérés par un moustique . Dans le moustique , un cycle de multiplication sexuée aboutit à la formation de sporozoïtes , qui peuvent être transmis à un nouvel hôte à l' occasion d' une piqûre ( d' après Silvie et al. , Médecine / Sciences 2003 ) . Les sporozoïtes peuvent également pénétrer dans les hépatocytes par effraction membranaire sans formation de vacuole , et migrer ainsi à travers plusieurs cellules avant de finalement en infecter une par formation d' une vacuole parasitophore ( Mota et al. , 2001 ) ( Figure 29 ) . Les sporozoïtes de différentes espèces de Plasmodium sont capables de migrer in vitro à travers différents types cellulaires issus de différentes espèces ( Mota et al. , 2001 ) . Ceci pourrait s' expliquer par la nécessité du parasite à traverser différents tissus de l' hôte , à savoir la peau , ensuite les capillaires sinusoïdes du foie , avant d' atteindre les hépatocytes ( Baldacci and Menard , 2004 ; Frevert , 2004 ) . Au sein de la vacuole parasitophore les sporozoïtes se différencient en schizontes hépatiques , qui au bout de 2 à 7 jours selon l' espèce , libèrent des milliers de mérozoïtes dans la circulation sanguine ( Figure 28 ) . Ces mérozoïtes infectent les globules rouges , également par formation d' une vacuole , et certains se différencient en gamétocytes , ce qui permet la poursuite du cycle parasitaire lorsqu' ils sont ingérés par un moustique ( Figure 28 ) . La phase de multiplication des parasites dans les globules rouges est responsable des symptômes de la maladie . Figure 29 . Le processus d' infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium . Les sporozoïtes sont séquestrés dans le foie grâce à l' interaction de protéines de surface du parasite avec les glycosaminoglycanes ( GAG ) proéminents dans les sinusoïdes hépatiques ( 1 ) . Après passage dans l' espace de Disse , qui sépare l' endothélium des capillaires sinusoïdes des hépatocytes sous-jacents , les sporozoïtes traversent plusieurs cellules par effraction membranaire ( 2 ) , avant de finalement infecter un hépatocyte par formation d' une vacuole ( 3 ) . Ce dernier processus est dépendant de l' expression de la tétraspanine CD81 à la surface de l' hépatocyte . Au sein de la vacuole parasitophore , les sporozoïtes se différencient en schizontes hépatiques ( 4 ) ( d' après Silvie et al. , Médecine / Sciences 2003 ) . Jusqu'à présent , la seule molécule connue des hépatocytes qui joue un rôle dans l' infection par plusieurs espèces de Plasmodium est la tétraspanine CD81 ( Figure 29 ) . En 2003 , Silvie et collaborateurs ont montré que la présence de CD81 à la surface des hépatocytes est nécessaire à l' infection par le Plasmodium falciparum , chez l' homme , et par le Plasmodium yoelii , chez la souris . En effet , les hépatocytes murins déficients en CD81 ne sont plus infectables par le P. yoelii , tant in vivo qu' in vitro , alors qu' aucun effet n' a été observé sur les hépatocytes déficients en CD9 . L' inoculation de souris déficientes en CD81 avec des mérozoïtes a résulté en une infection sanguine , suggérant que le blocage se fait avant la phase érythrocytaire ( Silvie et al. , 2003 ) . De plus , des anticorps anti-CD81 humain et murin , ou la réduction de leur expression par ARN interférence , inhibent le développement in vitro des deux espèces du parasite ( Silvie et al. , 2006a ; Silvie et al. , 2006b ; Silvie et al. , 2003 ) . Cet effet a été observé uniquement quand l' anticorps est ajouté avant ou pendant l' infection ( Silvie et al. , 2003 ) . De plus , la palmitoylation de CD81 n' est pas indispensable pour l' invasion des hépatocytes par P. yoelii ( Silvie et al. , 2006a ) . CD81 ne semble pas participer à la spécificité d' espèce du parasite . En effet , P. falciparum n' infecte pas des hépatocytes primaires issus de souris transgéniques déficientes pour la CD81 murine endogène , mais exprimant CD81 humaine . Par contre , l' expression de CD81 humaine restore l' infection des hépatocytes murins par P. yoelii in vivo et in vitro . Ce parasite n' est cependant pas responsable du paludisme chez l' homme , dû à des barrières d' espèce en dehors du foie ( Silvie et al. , 2006b ) . Un autre parasite de rongeur , Plasmodium berghei est capable d' envahir les hépatocytes par des mécanismes dépendants ou non de CD81 , selon la lignée de souris ou le type cellulaire analysé ( Silvie et al. , 2007 ) . De manière similaire à P. yoelii , la CD81 humaine est capable de restorer l' infection de P. berghei sur les cellules murines Hepa 1 - 6 déficientes en CD81 murine ( Silvie et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , CD81 présente dans les microdomaines à tétraspanines est impliquée dans l' infection par le parasite ( Silvie et al. , 2006a ) . Cela a été montré par l' utilisation de l' anticorps anti-CD81 MT 81w , qui reconnaît cette molécule uniquement lorsqu' elle est associée à d' autres molécules du tetraspanin web , à l' inverse , l' anticorps MT81 , qui reconnaît la population globale du CD81 exprimée dans les cellules ( Figure 20 ) . L' anticorps MT 81w inhibe l' invasion de cellules Hepa 1 - 6 et d' hépatocytes primaires de souris par P. yoelii de manière dose-dépendante , bien que le blocage de l' infection par cet anticorps ne soit pas aussi efficace que celui provoqué par le MT81 . Le traitement des cellules Hepa 1 - 6 avec de la M ? CB , avant l' inoculation des sporozoïtes , induit une inhibition du nombre de cellules infectées par P. falciparum et P. yoelii . De plus , après le traitement avec la M ? CB , l' inhibition observée dans les cellules murines est de la même magnitude que la réduction de la reconnaissance de CD81 par l' anticorps MT 81w . L' inhibition est complétement réversée par le réapprovisionnement des cellules en cholestérol avant l' inoculation ; et l' ajout de cholestérol sans traitement préalable avec la M ? CB augmente l' infection , ainsi que l' efficacité de blocage de MT 81w ( Silvie et al. , 2006a ) . Enfin , la M ? CB inhibe uniquement l' infection par le P. berghei dépendante de CD81 ( Silvie et al. , 2006a ; Silvie et al. , 2007 ) . L' ensemble de ces résultats montrent un rôle de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le Plasmodium ( Silvie et al. , 2006a ) . Récemment , une étude a permis d' identifier les résidus de CD81 critiques pour l' infection des cellules hôtes par les sporozoïtes de P. yoelii ( Yalaoui et al. , 2008 ) . En effet , des protéines chimériques entre CD81 et CD9 , qui ne supporte pas l' infection , ont permis de montrer l' importance de la LEL de CD81 pour l' infection . Les auteurs ont identifié 21 résidus , compris dans la région entre les hélices A et B et dans l' hélice B de la LEL , suffisants pour permettre l' infection . De plus , un résidu en position 137 ( D137 ) joue un rôle clé , puisque sa mutation avec les résidus adjacents abolit complètement la capacité de CD81 à supporter l' infection par le parasite . Bien que l' hélice C de la LEL ne soit pas essentielle , elle contribue à la fonction de CD81 pendant l' infection . De plus , des mutants de la région localisée entre les hélices A et B sont capables d' interagir normalement avec les partenaires de CD81 , EWI- 2 et EWI-F , suggérant que leur incapacité à permettre l' infection par le P. yoelii n' est pas liée à une perte d' interaction avec l' un de ces partenaires . Cette étude montre également que l' hélice D , en général critique pour les fonctions spécifiques des tétraspanines ( Hasuwa et al. , 2001 ; Kazarov et al. , 2002 ; Zhu et al. , 2002 ) , ne joue pas un rôle direct dans l' entrée du Plasmodium . Ceci est en accord avec le fait que CD81 humaine et murine soient toutes les deux capables de permettre l' infection , bien que l' hélice D soit la région la plus divergente entre ces deux molécules , avec 59 % de conservation et 66 % de similarité ( Yalaoui et al. , 2008 ) . Toutefois , aucune interaction directe entre CD81 et le parasite n' a été mise en évidence ( Silvie et al. , 2003 ) , suggérant que cette molécule ne serait pas un récepteur . CD81 aurait plutôt un rôle indirect dans l' infection . Bien que le mécanisme exact reste à determiner , CD81 pourrait être impliqué directement ou indirectement dans la formation de la vacuole parasitophore qui est nécessaire à la différentiation du parasite ( Silvie et al. , 2007 ; Silvie et al. , 2006b ; Silvie et al. , 2003 ) . OBJECTIFS DU TRAVAIL Comme nous l' avons vu dans la partie III , les mécanismes d' entrée du VHC dans ses cellules cibles ne sont pas encore complétement établis . Plusieurs molécules participent à cette étape du cycle , mais leur rôles spécifiques ne sont pas clairement définis . De plus , certaines lignées cellulaires humaines exprimant les facteurs , LDL-R , GAG , SR-BI , CD81 et CLDN- 1 , démeurent résistantes à l' infection par le VHC . Ceci suggère qu' un ou plusieurs facteurs de l' hôte restent à identifier . Nous nous sommes concentrés sur la tétraspanine CD81 . Les protéines de cette famille ont la particularité d' interagir entre elles et avec d' autres protéines , appelées partenaires , pour former un réseau à la surface des cellules , appelé tetraspanin web ou microdomaine enrichi en tétraspanines . Dans la première partie de ma thèse , nous avons étudié le rôle d' un partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , dans l' infection par le VHC . Ces résultats ont fait l' objet de la publication suivante , disponible dans la partie I des résultats : Rocha-Perugini V. , Montpellier C. , Delgrange D. , Wychowski C. , Helle F. , Pillez A. , Drobecq H. , Le Naour F. , Charrin S. , Levy S. , Rubinstein E. , Dubuisson J. and Cocquerel L. ( 2008 ) . The CD81 partner EWI- 2 wint inhibits Hepatitis C Virus entry . PLoS ONE 3 ( 4 ) , e 1866 . Comme nous l' avons vu dans la partie IV.5.3 , CD81 , et plus spécifiquement CD81 associée au tetraspanin web , joue un rôle dans l' étape hépatique de l' infection des parasites Plasmodium . Comme pour le VHC , l' attachement de ces parasites aux hépatocytes se fait par l' association aux GAG et le cholestérol membranaire joue un rôle important dans l' infection . Les similarités entre les mécanismes d' entrée du VHC et d' infection hépatique des sporozoïtes de Plasmodium nous ont amené à analyser , dans la deuxième partie de ma thèse , le rôle de CD81 associée au tetraspanin web dans l' infection du VHC . Le travail décrivant ces résultats a été soumis pour publication et est disponible dans la partie II des résultats : Rocha-Perugini V. , Lavie M. , Delgrange D. , Canton J. , Pillez A. , Rubinstein E. , Dubuisson J. , Wychowski C. and Cocquerel L. ( 2008 ) . The association of CD81 with tetraspanin-enriched microdomains is not essential for Hepatitis C Virus entry . RESULTATS I. Article 1 Le partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , inhibe l' entrée du Virus de l' Hépatite C II . Article 2 L' association de CD81 avec les microdomaines enrichis en tétraspanines n' est pas essentielle à l' entrée du Virus de l' Hépatite C Discussion et Perspectives Le VHC utilise plusieurs récepteurs pour entrer dans les cellules , tels que les GAG , le LDL-R , le SR-BI et la CD81 . Cependant , l' expression de ces molécules n' étant pas limitée aux hépatocytes , cela n' explique pas le tropisme viral pour le foie . Récemment , il a été montré que la Claudine- 1 participe également à l' entrée virale , mais son expression n' est pas non plus limitée aux hépatocytes . De plus , il a été montré que les Claudines - 6 et - 9 sont également capables de rendre certaines lignées non hépatocytaires permissives à l' infection . En effet , l' expression ectopique de ces trois Claudines dans des lignées telles que les HEK-293T permet l' infection par le VHC . Toutefois , d' autres lignées cellulaires demeurent résistantes , telle que les HeLa . Ceci suggère qu' un ou plusieurs facteur ( s ) additionnel ( s ) de l' hôte joue ( ent ) un rôle dans le mécanisme d' entrée du VHC . Durant ma thèse , nous nous sommes intéressés à la tétraspanine CD81 et tout particulièrement à sa capacité à intéragir avec d' autres tétraspanines et avec des protéines partenaires . 1 . Le partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , inhibe l' entrée du VHC Dans ce travail , nous avons identifié un partenaire de CD81 capable d' inhiber l' interaction in vitro entre le récepteur CD81 et les glycoprotéines virales E1 et E2 . Nous avons en effet observé l' absence d' interaction entre des hétérodimères E1E2 immobilisés sur des billes et CD81 issue de certaines lignées cellulaires , lysées dans des conditions de détergents qui gardent les complexes primaires ou les tetraspanin webs intacts . Nous avons montré qu' il y avait une corrélation directe entre l' expression cellulaire de ce partenaire , normalement absent des hépatocytes , et l' inhibition de l' interaction CD81 / E1E2 . Des analyses de spectrométrie de masse ont montré que ce nouveau partenaire , appelé EWI- 2 wint , est issu du clivage de la protéine EWI- 2 , un des partenaires majeurs de CD81 . EWI- 2 appartient à une sous-famille de protéines à domaines Ig , appelées protéines EWI , récemment décrite . Nous avons montré que le clivage d' EWI- 2 pour former EWI- 2 wint a lieu entre les deux premiers domaines Ig N-terminaux d' EWI- 2 . C' est pourquoi , nous avons appelé cette protéine EWI- 2 wint , pour EWI- 2 without its N-terminus . Nos tentatives pour exprimer EWI- 2 wint directement dans les lignées hépatocytaires ont été infructueuses , suggérant que la protéine EWI- 2 wint ( EWI- 2 sans son domaine N-terminal ) est probablement instable dans la voie de sécrétion . L' expression d' EWI- 2 wint dans ces cellules a été obtenue par l' ajout d' une arginine en amont de la séquence d' EWI- 2 wint , formant une protéine EWI- 2 avec un site de clivage de l' endopeptidase furine ( RGRR ) . Ce site de clivage naturel est formé par le motif RGR présent dans la séquence d' EWI- 2 , juste en amont de la séquence d' EWI- 2 wint et l' arginine qui a été ajoutée . Des cellules hépatocytaires Huh- 7 exprimant de manière stable EWI- 2 avec ce site de clivage modifié permettent une forte production d' EWI- 2 wint . De manière intéressante , l' infection par les VHCcc est réduite dans les cellules produisant EWI- 2 wint , par rapport aux cellules contrôles qui ne l' expriment pas . De plus , EWI- 2 wint n' affecte ni les étapes de synthèse des protéines virales et de réplication du génome , ni celles d' assemblage et de sécrétion de nouvelles particules virales . En effet , ceci a été démontré par la transfection de l' ARN viral dans les cellules exprimant ou non EWI- 2 wint et par l' utilisation du surnageant de ces cellules transfectées pour infecter des cellules naïves . Les cellules transfectées exprimaient des niveaux de la protéine de capside virale similaires aux cellules contrôles . L' infectiosité des surnageants de culture des cellules produisant EWI- 2 wint indiquait que la transfection de l' ARN viral dans ces cellules permettait l' assemblage et la sécrétion de particules néosynthetisées de manière comparable aux cellules contrôles . De manière originale , nous avons montré que l' expression d' EWI- 2 wint est capable d' inhiber l' entrée du VHC dans ses cellules cibles , en altérant l' interaction récepteur-glycoprotéines virales . Ce type de mécanisme d' inhibition n' avait jamais été montré auparavant et il nous permet de jeter un regard nouveau non seulement sur les mécanismes précoces d' entrée du VHC , mais également sur les premières étapes du cycle infectieux d' autres agents pathogènes . Une connaissance détaillée du processus par lequel EWI- 2 wint est produite , de son mode d' interaction avec CD81 , de sa localisation subcellulaire et de son interaction avec d' autres molécules du tetraspanin web ou des molécules impliquées dans des voies de signalisation est essentielle pour la compréhension de sa fonction inhibitrice sur l' infection du VHC . La résistance au VHC pourrait donc être non seulement liée à l' absence d' expression de facteurs spécifiques permettant l' entrée virale , mais également à l' expression d' EWI- 2 wint dans ces cellules . L' absence de permissivité des cellules HEK-293T a été associée à une absence d' expression des CLDN , puisque leur expression ectopique permet de conférer une sensibilité à l' infection ( Evans et al. , 2007 ; Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) . De manière intéressante , nous avons observé que ces cellules n' expriment pas EWI- 2 wint . Pour les cellules non permissives exprimant EWI- 2 wint , son influence dans l' hépatotropisme viral pourrait être analysée à travers l' utilisation d' ARN interférents dirigés contre EWI- 2 . Le traitement de cellules non permissives qui expriment tous les facteurs d' entrée positifs et le facteur négatif EWI- 2 wint devrait les rendre permissives à l' infection . Nous avons identifié deux lignées cellulaires non permissives exprimant les différents facteurs d' entrée ainsi qu' EWI- 2 wint , les cellules HeLa exprimant de manière ectopique les CLDN et les cellules de carcinome épidermique A431 . Cependant , ces deux lignées ne sont pas permissives à la réplication du génome du VHC . Des expériences supplémentaires avec des lignées cellulaires non permissives exprimant tous les facteurs d' entrée positifs connus et supportant la réplication du génome viral sont nécessaires pour déterminer si l' inhibition de EWI- 2 wint endogène est suffisante pour induire une permissivité au VHC . Dans nos expériences , nous pourrons utiliser des VHCcc-luciférase , qui permettent une quantification très sensible des niveaux d' infection par la mesure de l' activité de la luciférase . D' autre part , l' étape d' entrée virale pourrait être étudiée en utilisant les VHCpp . Des expériences d' interaction in vitro entre CD81 issu de cellules traitées et des hétérodimères E1E2 du VHC pourraient confirmer nos résultats . Nous avons également utilisé des ARN interférents dirigés contre EWI- 2 pour restaurer l' infection des Huh- 7 produisant EWI- 2 wint par le clivage par la furine . Néanmoins , nos résultats n' ont pas été concluants . Il nous a été très difficile d' inhiber complétement EWI- 2 . Dans ce sens , il semblerait qu' EWI- 2 wint soit capable d' inhiber l' infection du VHC même lorsqu' elle est exprimée faiblement . Toutefois , il est important de noter que le traitement des cellules Huh- 7 naïves avec des ARN interférents dirigés contre EWI- 2 n' affecte pas l' infection des VHCcc . Ceci indique que , bien qu' EWI- 2 soit un partenaire majeur de CD81 , elle ne participe pas au processus d' entrée du VHC . 2 . Caractérisation du mécanisme inhibiteur d' EWI- 2 wint Bien qu' EWI- 2 wint soit capable d' inhiber l' entrée du VHC , le mécanisme exact d' inhibition reste à déterminer . En effet , il serait intéressant de savoir si EWI- 2 wint masque l' accessibilité des glycoprotéines virales à CD81 par encombrement stérique ; si EWI- 2 wint induit un changement conformationnel dans la structure de CD81 empêchant son interaction avec le virus ; si EWI- 2 wint bloque l' association et/ou la dissociation de CD81 avec d' autres molécules jouant un rôle dans l' entrée virale ; si EWI- 2 wint bloque la ( les ) voie ( s ) de signalisation induite ( s ) par CD81 suite à l' interaction avec le virus ; ou alors si EWI- 2 wint modifie l' association de CD81 avec les microdomaines enrichis en tétraspanines . Par ailleurs , nous sommes en train de produire des formes solubles d' EWI- 2 wint afin d' identifier celle ayant le même pouvoir inhibiteur que la protéine entière . Ces formes devraient permettre d' identifier le ( s ) domaine ( s ) impliqué ( s ) dans l' inhibition de l' interaction entre E1E2 et CD81 afin de développer des peptides ou mini-protéines qui pourront constituer de nouveaux outils potentiels dans le cadre du développement de nouveaux agents thérapeutiques . Une autre stratégie thérapeutique serait d' induire , dans les hépatocytes , le clivage d' EWI- 2 conduisant à la production d' EWI- 2 wint . Néanmoins , le rôle physiologique d' EWI- 2 n' est pas encore bien établi . 2.1 . Les domaines d' interaction entre CD81 et EWI- 2 wint Dans la continuité de mon travail , il serait intéressant d' identifier les domaines d' interaction entre EWI- 2 wint et CD81 à l' aide de protéines chimériques entre les protéines de la famille EWI ( EWI- 2 / EWI-101 et EWI- 2 wint / EWI- 101 ) , ainsi qu' entre les tétraspanines CD81 et CD82 , qui ne s' associe pas à EWI- 2 . Une analyse plus fine des résidus impliqués dans cette interaction pourra alors être envisagée par mutagenèse dirigée . Des régions d' interaction entre les tétraspanines et leurs partenaires ont été identifiées à l' aide de protéines chimériques . Il apparaît que ces régions diffèrent d' une tétraspanine à l' autre et d' un partenaire à l' autre . En effet , l' interaction CD81 / CD19 fait intervenir la LEL de CD81 et le domaine extracellulaire de CD19 , bien que le premier TMD de CD81 puisse également être impliqué ( Shoham et al. , 2006 ) . L' interaction entre la tétraspanine CD151 et l' intégrine ? 3 ? 1 semble se faire également entre la LEL de CD151 et le domaine extracellulaire de l' intégrine ( Berditchevski et al. , 2001 ) . Par contre , deux régions de la tétraspanine CD9 semblent jouer un rôle dans son association avec EWI- 2 : une région comprise entre la moitié du deuxième TMD et le début de la LEL , et une région comprise entre le motif CCG de la LEL et le quatrième TMD ( Charrin et al. , 2003a ) . Ces deux régions contribuent de manière indépendante à l' interaction avec EWI- 2 , néanmoins les deux sont nécessaires pour observer un niveau d' interaction maximal . Ces régions de CD9 ont peu de similarité de séquence avec CD81 , suggérant que celle  -ci s' associe avec EWI- 2 d' une manière différente ( Charrin et al. , 2003a ) . De son côté , la région d' EWI- 2 responsable de son interaction avec les tétraspanines CD81 et CD9 est probablement présente dans l' extrémité C-terminale de la protéine ( Charrin et al. , 2003a ; Kolesnikova et al. , 2004 ; Stipp et al. , 2001a ; Stipp et al. , 2003a ) . En effet , une protéine chimérique où la queue cytoplasmique d' EWI- 2 a été remplacée par celle de la protéine CD2 ne s' associe plus à CD81 , alors que l' interaction avec CD9 est conservée ( Stipp et al. , 2003a ) . Des résultats préliminaires avec les chimères CD81 / CD82 indiquent qu' un ou plusieurs TMD de CD81 pourraient être impliqués dans l' interaction avec EWI- 2 et EWI- 2 wint . En effet , les chimères CD81 / CD82 possèdant les deuxième et troisième TMD de CD82 présentent une interaction très réduite avec EWI- 2 et EWI- 2 wint . Le quatrième TMD et la SEL de CD81 ne semblent pas être impliqués . De manière intéressante le premier , le deuxième et le troisième TMD de CD81 possèdent un motif à glycine G / A / SXXXG / A / S qui pourrait interagir avec les TMD d' EWI- 2 et EWI- 2 wint qui présentent un double domaine à glycine GXXXAXXXG suivi d' un simple motif AXXXG . Ce type de domaine à glycine , appelé glycine zipper ( G / A / SXXXG / A / SXXXG / A / S ) est décrit comme un domaine d' interaction et d' hétérodimèrisation ( Kim et al. , 2005 ) . EWI-F , un autre membre de la famille des EWI capable d' interagir avec CD81 , contient aussi un glycine zipper dans son TMD ( GXXXSXXXG ) . Nos analyses indiquent qu' EWI- 2 et EWI- 2 wint hétérodimèrisent et que cette interaction est stable même dans des conditions de détergents qui normalement dissocient le tetraspanin web , comme le Triton X-10 0 . Il serait donc possible que , dans le contexte cellulaire naturel , EWI- 2 wint interagisse avec CD81 via EWI- 2 . Dans le but d' analyser l' hétérodimèrisation entre EWI- 2 et EWI- 2 wint , ainsi que leur interaction avec CD81 via le domaine glycine zipper présent dans leur TMD , nous avons substitué les glycines par des leucines . De manière intéressante , ces mutations n' ont pas altéré l' interaction entre EWI- 2 et EWI- 2 wint , mais tous les mutants présentaient des interactions réduites avec CD81 . Des insertions d' alanines dans les domaines à glycines présents dans les TMD de CD81 et dans le TMD d' EWI- 2 / EWI- 2 wint devraient permettre de déterminer quels résidus sont importants pour l' interaction entre CD81 et EWI- 2 / EWI- 2 wint . D' autre part , il a été montré qu' EWI-F est capable d' inhiber l' association de la prostaglandine F2 ? à son récepteur , en s' associant avec lui et en diminuant son expression ( Orlicky , 1996 ) . Cependant , EWI- 2 wint n' induit pas une diminution du nombre de récepteurs CD81 capables de se lier aux glycoprotéines virales . Une autre hypothèse serait qu' EWI- 2 wint pourrait interagir directement avec le virus . Cette possibilité pourrait être investiguée par pontage covalent des particules virales avec des cellules exprimant EWI- 2 wint . Cependant , des grandes quantités de virus purifiés sont nécessaires pour de telles expériences . D' autres possibilités seraient de réaliser des interactions in vitro entre les hétérodimères E1E2 du VHC et la protéine EWI- 2 wint immobilisée sur des billes , ou alors des infections avec des particules virales pré-incubées avec une forme soluble d' EWI- 2 wint . L' utilisation d' un panel d' anticorps monoclonaux , conformationnels ou non , dirigés contre CD81 devrait permettre de déterminer si EWI- 2 wint bloque le site de CD81 responsable de l' interaction avec E1E2 du VHC . Des changements conformationnels ont par exemple lieu dans la tétraspanine CD9 lorsque celle  -ci est associée aux intégrines ? 1 ( Gutierrez-Lopez et al. , 2003 ) . 2.2 . EWI- 2 wint et l' association / dissociation de CD81 avec d' autres molécules Les données obtenues jusqu'à présent sur l' étape d' entrée du VHC indiquent que la tétraspanine CD81 joue un rôle après l' attachement des particules virales ( Cormier et al. , 2004b ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Morikawa et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Il semblerait que CD81 et SR-BI coopèrent pendant une étape post-attachement du virus , avec des participations intimement liées ( Kapadia et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . De plus , la CLDN- 1 est capable d' interagir avec CD81 et LDL-R lorsqu' elle est sur-exprimée dans les cellules ( Yang et al. , 2008 ) et il semblerait qu' elle participe à l' entrée virale après l' action de CD81 et de SR-BI ( Evans et al. , 2007 ) . L' ensemble de ces résultats indique que l' entrée du VHC dans les hépatocytes a lieu après des interactions successives du virus avec ces différentes molécules , suggérant que leur association et/ou dissociation sont probablement des processus importants pour le mécanisme d' entrée . Comme expliqué dans l' introduction , la composition du tetraspanin web varie selon la lignée cellulaire et les tétraspanines ont une influence sur les fonctions de leurs partenaires . Les partenaires pourraient également influencer les interactions entre les membres du tetraspanin web et EWI- 2 wint pourrait bloquer l' association et/ou la dissociation de CD81 avec d' autres molécules jouant un rôle dans l' entrée virale . Afin d' investiguer cette hypothèse , il serait intéressant d' étudier les régions d' association , dans la membrane plasmique , à la fois entre CD81 et EWI- 2 wint et entre CD81 et les autres molécules de l' entrée virale . Des analyses de localisation subcellulaire de CD81 et d' EWI- 2 wint sont en cours afin de savoir si EWI- 2 wint modifie la localisation subcellulaire de CD81 . Dans ce sens , il a été montré que la surexpression d' EWI- 2 est capable d' induire une re-localisation de CD81 vers la périphérie cellulaire , surtout au niveau des filopodes , zones riches en intégrine ? 3 ? 1 ( Stipp et al. , 2003a ) . En outre , des expériences de microscopie confocale devraient permettre de déterminer si CD81 , SR-BI , CLDN et EWI- 2 wint colocalisent ou non . De manière plus détaillée , les dynamiques de distribution de ces molécules dans la membrane plasmique pourraient être analysées par microscopie TIRF ( total internal reflection fluorescence ) , où chaque molécule est marquée par un anticorps de couleur différente et leurs mouvements à la membrane sont observés par microscopie en temps réel ( live imaging ) . De plus , des analyses de l' interaction de ces protéines par FRET ( fluorescence resonance energy transfert ) pourraient indiquer s' il existe une interaction physique entre les protéines à la membrane cellulaire . Récemment , Harris et collaborateurs ont réalisé ce type d' analyse et ont montré que CD81 et CLDN- 1 s' associent à la membrane des hépatocytes ( Harris et al. , 2008 ) . 2.3 . EWI- 2 wint et CD81 , les voies de signalisation et l' interaction avec le cytosquelette Les tétraspanines sont capables d' induire des voies de signalisation intracellulaires , par exemple via leur interaction avec les intégrines , en agissant comme des « adaptateurs » entre les intégrines et des molécules de signalisation ( Berditchevski and Odintsova , 1999 ; Berditchevski et al. , 1997 ; Zhang et al. , 2001 ) . Les tétraspanines peuvent également interagir directement avec des molécules de signalisation , comme la PKC ( Zhang et al. , 2001 ) et les récepteurs couplés aux protéines G ( Little et al. , 2004 ) , ou encore activer des voies de signalisation , telles que la voie ERK / MAPK ( Cai et al. , 1997 ; Carloni et al. , 2004 ; Kolch et al. , 1993 ; Murayama et al. , 2004 ) . CD81 est une protéine adaptatrice avec ses domaines extra-cellulaires qui interagissent avec les protéines de surface et ses queues cytoplasmiques qui interagissent avec les molécules de signalisation , comme la PKC ( Zhang et al. , 2001 ) . Toutefois , les voies de signalisation activées par le VHC via les récepteurs cellulaires ont été jusqu'à présent peu exploitées . Récemment , il a été montré que , dans les cellules Huh- 7 , l' activation de la voie des Rho GTPases par l' engagement de CD81 induit une relocalisation des complexes E2 / CD81 vers les régions riches en CLDN- 1 , de manière dépendante de l' actine ( Brazzoli et al. , 2008 ) . Une autre étude récente montre que l' interaction entre CD81 et CLDN- 1 à la surface des cellules hépatocytaires Huh- 7.5 est dépendante de la protéine kinase A ( PKA ) et que les cellules infectées présentent des niveaux augmentés d' AMP cyclique et de substrats phosphorylés de la PKA ( Farquhar et al. , 2008 ) . De plus , il a été montré que dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 , les hépatocytes primaires L02 , les cellules lymphoïdes Molt- 4 et des lymphocytes T , la voie de signalisation des kinases ERK / MAPK est stimulée par la glycoprotéine E2 via CD81 et LDL-R ( Crotta et al. , 2006 ; Zhao et al. , 2005 ; Zhao et al. , 2006 ; Zhao et al. , 2007 ) . L' activation de cette voie par l' engagement de CD81 semble faire partie des événements post-entrée virale ( Brazzoli et al. , 2008 ) . Par contre , dans les cellules NK cette voie de signalisation est inhibée par l' engagement de CD81 par E2 ( Crotta et al. , 2006 ) . Les hépatocytes et les cellules lymphoïdes Molt- 4 n' expriment pas EWI- 2 wint , alors que son expression dans les cellules NK n' est pas connue . Dans l' hypothèse que l' interaction entre CD81 et E2 induit des voies de signalisation intracellulaire , l' effet inhibiteur d' EWI- 2 wint pourrait se faire par un blocage de l' induction de cette ( ces ) voie ( s ) . L' interaction des tétraspanines avec les partenaires , notamment les intégrines , permet une association avec le cytosquelette des cellules . Par ailleurs , EWI- 2 , EWI-F et CD81 colocalisent et interagissent avec les protéines ERM , concentrées dans les structures riches en actine et impliquées dans les interactions entre la membrane plasmique et le cytosquelette ( Sala-Valdes et al. , 2006 ) . Ces protéines existent sous deux états conformationnels : une forme repliée inactive et soluble dans le cytoplasme , et une forme active dépliée ( Louvet-Vallee , 2000 ) . Cet état conformationnel dépend de la phosphorylation de résidus tyrosine conservés présents dans leur domaine C-terminal . Cette phosphorylation dissocie l' association intramoléculaire entre les domaines N- et C-terminaux de la forme inactive , permettant ainsi à la protéine de se déplier et d' acquérir une forme active . Il a été montré que la réplication du VHC semble requérir la polymérisation d' actine et des microtubules ( Bost et al. , 2003 ) , qui pourrait être induite par l' engagement de CD81 . En effet , l' engagement de CD81 par des anticorps monoclonaux dirigés contre celle  -ci ou par la glycoprotéine E2 induit une phosphorylation de l' ezrine ( Coffey , 2006 ) et un réarrangement des filaments d' actine ( Coffey , 2006 ; Crotta et al. , 2006 ) . Ce réarrangement relocalise les complexes E2 / CD81 vers les régions riches en CLDN- 1 ( Brazzoli et al. , 2008 ) . EWI- 2 wint pourrait interférer avec la phosphorylation des protéines ERM et la polymérisation des filaments d' actine , potentiellement nécessaire au mécanisme d' entrée du VHC . 3 . Caractérisation de la protéine EWI- 2 wint La connaissance détaillée du processus par lequel EWI- 2 wint interagit avec CD81 , de son interaction avec d' autres molécules du tetraspanin web ou des molécules impliquées dans des voies de signalisation est en effet nécessaire à la compréhension de sa fonction inhibitrice sur l' infection du VHC . Mais l' étude du mécanisme de production d' EWI- 2 wint , de sa biogenèse et de sa localisation subcellulaire est également essentielle . Il est important de déterminer par exemple pourquoi le clivage d' EWI- 2 n' a pas lieu dans les hépatocytes . Une hypothèse serait l' absence d' expression de la protéase impliquée . Il est également possible que les hépatocytes produisent un inhibiteur de protéase qui bloque spécifiquement son activité . Dans ce sens , il est connu que les cellules produisent des inhibiteurs de protéases , notamment les hépatocytes , qui produisent par exemple des inhibiteurs de l' alpha- 1- protéinase ( Crowther et al. , 2004 ; Parfrey et al. , 2003 ) . En sachant que le tetraspanin web est cellule- et tissu-spécifique , une autre possibilité serait que dans les cellules qui expriment EWI- 2 mais pas EWI- 2 wint , le site de clivage d' EWI- 2 ne serait pas accessible à la protéase , grâce au tetraspanin web . L' accessibilité à la protéase pourrait alors être modulée par d' autres composants du tetraspanin web , qui pourraient varier selon le type cellulaire ( Boucheix and Rubinstein , 2001 ; Levy and Shoham , 2005b ) . 3.1 . Clivage d' EWI- 2 pour former EWI- 2 wint Des analyses par mutagenèse dirigée nous ont permis d' identifier le site consensus de clivage dans la séquence d' EWI- 2 qui est à l' origine d' EWI- 2 wint . Cependant , ce site consensus , RXR ( où X est n' importe quel acide aminé ) , ne correspond à aucune protéase connue . De plus , des marquages métaboliques réalisés dans des cellules de hamster CHO indiquent que le clivage d' EWI- 2 a lieu après la maturation de ses glycanes , indiquant que la protéase à l' origine d' EWI- 2 wint est probablement localisée dans l' appareil de Golgi . Dans les cellules Huh- 7 , le motif RGRR reconnu par l' endopeptidase furine permet une production efficace d' EWI- 2 wint . Etant donné qu' EWI- 2 peut être clivée au site RGR pour produire EWI- 2 wint , il est possible que la protéase clivant le site RXR soit une enzyme proche de la furine . L' enzyme furine est une sérine-protéase , appartenant à la famille des proprotéines convertases de type subtilisine ( Hook et al. , 1994 ; Nakayama , 1997 ; Taylor et al. , 2003 ; Thomas , 2002 ) , dont le site de clivage de référence , R-X-K / R-R , est différent de ceux des autres enzymes connues de la famille ( Hook et al. , 1994 ; Nakayama , 1997 ) . Cependant , aucun de ces sites connus ne correspond à RXR . Plusieurs enzymes de cette famille , dont la furine , possèdent une distribution ubiquitaire ( Hatsuzawa et al. , 1990 ; Seidah et al. , 1991 ; Smeekens , 1993 ; Steiner et al. , 1992 ) . De plus , la furine est capable de cliver plusieurs protéines cellulaires , notamment neuroendocrines ( Seidah et al. , 1991 ; Smeekens , 1993 ; Steiner et al. , 1992 ) , et elle est présente dans le trans-Golgi , comme les autres protéines de cette famille . La furine est également présente à la surface cellulaire , où elle est responsable du clivage de toxines diphtérique et de l' anthrax , permettant leur activation ( Nakayama , 1997 ) . Certains substrats de ces enzymes sont spécifiques , alors que d' autres peuvent être clivés par les différentes proprotéines convertases ( Taylor et al. , 2003 ) . Des analyses supplémentaires avec des inhibiteurs de protéases et avec des ARN interférents devraient nous permettre d' identifier la protéase impliquée dans le clivage d' EWI- 2 et responsable de la production d' EWI- 2 wint . Une autre famille de sérine-protéases , les chimiotryptases , pourraient également être impliquées . En effet , deux enzymes de cette famille , la tryptase beta et le composant activé du complément C 1r , reconnaissent des sites de clivage proches du site consensus RXR : RNR et RQR , respectivement ( Arlaud et al. , 2002 ; Karlson et al. , 2002 ) . Toutefois , la séquence d' EWI- 2 en amont d' EWI- 2 wint présente un site RGR . 3.2 . Profil d' expression tissulaire et cellulaire d' EWI- 2 wint Nous avons montré que certaines lignées cellulaires expriment EWI- 2 et produisent EWI- 2 wint ( Daudi , Ramos et A431 ) , tandis que d' autres expriment EWI- 2 sans production d' EWI- 2 wint ( Lignées hépatocytaires , hépatocytes primaires , Molt- 4 , HEK-293T ) . D' autres encore n' expriment aucune de ces deux protéines à la surface ( U937 ) . En accord avec nos résultats , il a été montré que dans les cellules U937 , EWI- 2 n' atteint pas la membrane plasmique ( Stipp et al. , 2003a ) . Du fait de l' absence d' anticorps capables de reconnaître EWI- 2 wint , ces analyses d' expression d' EWI- 2 wint ont été réalisées par biotinylation de surface suivie de co-immunoprécipitation avec un anticorps anti-CD81 , dans des conditions de détergents qui gardent les complexes primaires intacts . Des protéines de 70 kDa et 55 kDa ont été identifiées comme EWI- 2 et EWI- 2 wint , respectivement . Néanmoins , nous ne pouvons pas exclure la possibilité que d' autres protéines de la même taille aient été co-immunoprécipitées avec l' anti-CD81 . De ce fait , nous tentons actuellement de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre EWI- 2 et EWI- 2 wint , qui nous permettront d' établir le profil d' expression tissulaire et cellulaire de ces protéines . Par ailleurs , à l' aide de nos protéines taggées , nos résultats préliminaires indiquent que , dans les cellules CHO , EWI- 2 wint est notamment exprimée dans les endosomes , alors qu' EWI- 2 est plutôt présente à la surface des cellules . L' utilisation de nos anticorps monoclonaux dirigés directement contre ces protéines nous permettront par la suite de confirmer ces résultats . 3.3 . La voie de sécrétion et les modifications post-traductionnelles subies par EWI- 2 wint Enfin , nous nous sommes intéressés au trafic intracellulaire d' EWI- 2 wint , ainsi qu' aux modifications post-traductionnelles subies par celle  -ci . Il serait en effet intéressant de définir dans quel compartiment intracellulaire l' association entre EWI- 2 / EWI- 2 wint et CD81 a lieu . Stipp et collaborateurs ont montré que , dans les cellules U937 , sans CD81 , EWI- 2 reste sous une forme immature sous-glycosylée dans le cytoplasme , avec des niveaux d' expression plus faibles ( Stipp et al. , 2003a ) . Les auteurs suggèrent que l' interaction entre EWI- 2 et CD81 a lieu dans le RE / pré-Golgi ( Stipp et al. , 2003a ) . D' autre part , il a été montré que CD81 est également nécessaire à la maturation des glycanes d' une autre protéine partenaire , CD19 , ainsi qu' à son expression à la surface ( Shoham et al. , 2006 ) . De manière similaire , les tétraspanines UPIa et UPIb sont nécessaires pour la sortie de leurs partenaires UPII et UPIII du RE sous des formes hétérodimériques . UPIa est également importante pour le clivage protéolytique d' UPII par la furine dans le trans-Golgi . Sans UPIa , UPII est en effet dégradée par le proteasome ( Hu et al. , 2005 ) . Dans les cellules CHO , les profils de migration d' EWI- 2 et d' EWI- 2 wint sont similaires lorsqu' EWI- 2 est exprimée seule ou co-exprimée avec la CD81 humaine , cependant nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la CD81 d' hamster soit responsable de la maturation d' EWI- 2 dans ces cellules . Toutefois , nos résultats préliminaires d' expression d' EWI- 2 et EWI- 2 wint ( par le clivage d' EWI- 2 par la furine ) indiquent que dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 w 7 , qui n' expriment plus de CD81 , EWI- 2 et EWI- 2 wint n' ont pas besoin de CD81 comme chaperon pour être correctement maturées et exprimées à la surface cellulaire . De plus , le clivage d' EWI- 2 pour former EWI- 2 wint , par l' enzyme furine , a lieu normalement en absence de CD81 dans les cellules Huh- 7 w 7 . Pour confirmer l' absence de rôle de CD81 dans la maturation d' EWI- 2 , il serait également intéressant d' utiliser une chimère CD81 / CD82 qui n' interagit plus avec EWI- 2 / EWI- 2 wint dans le contexte cellulaire des Huh- 7 w 7 . EWI- 2 est une protéine présentant trois sites potentiels de N-glycosylation ( NXS / T , où X est n' importe quel acide aminé sauf la proline ) , dans le premier , le troisième et le quatrième domaine Ig . EWI- 2 wint n' en possède donc que deux . Nous avons muté les sites des deux protéines et en effet ils sont tous N-glycosylés . La N-glycosylation d' EWI- 2 n' est pas nécessaire à son clivage pour former EWI- 2 wint , cependant EWI- 2 avec les trois sites mutés est une protéine instable , faiblement exprimée à la surface des cellules . Par ailleurs , la co-transfection des mutants de N-glycosylation d' EWI- 2 avec CD81 indique que la N-glycosylation n' est pas nécessaire à l' interaction CD81 / EWI-2 , ni CD 81 / EWI- 2 wint . Par contre , les résultats indiquent qu' EWI- 2 wint exprimée directement pourrait ne pas subir certaines modifications post-traductionnelles . La séquence de ces protéines présente en effet des sites potentiels de O-glycosylation et de palmitoylation . Les protéines EWI- 2 et CD81 sont des protéines palmitoylées et , par exemple , la palmitoylation de CD9 bloque partiellement son accessibilité à EWI- 2 ( Yang et al. , 2006 ) . La mutation des sites de palmitoylation d' EWI- 2 / EWI- 2 wint et de CD81 serait nécessaire pour analyser leur influence sur les interactions entre ces protéines . Nos résultats préliminaires indiquent que CD81 avec tous ses sites de palmitoylation mutés interagit normalement avec EWI- 2 / EWI- 2 wint . De manière générale , les tétraspanines favorisent l' export de leurs partenaires du RE , leur stabilité et leur présentation en surface ( Hu et al. , 2005 ) . Cependant , EWI- 2 wint co-exprimée directement ( sans EWI- 2 comme intermédiaire ) avec CD81 est une protéine instable qui n' arrive pas à la surface cellulaire . Des résultats similaires ont été obtenus lorqu'elle est co-exprimée avec d' autres tétraspanines , telles CD9 et CD82 , et avec la protéine SR-BI . Par contre , EWI- 2 wint co-exprimée avec le LDL-R arrive à la surface cellulaire . Des expériences supplémentaires avec des inhibiteurs de protéasome pourraient nous indiquer si EWI- 2 wint est dirigée vers une voie de dégradation . L' instabilité d' EWI- 2 wint exprimée directement , sans clivage préalable d' EWI- 2 et sans co-expression avec CD81 , est confirmée par le fait que les mutants de N-glycosylation d' EWI- 2 wint ne sont presque pas exprimés à la surface des CHO . De plus , comme cité précédemment , nous n' avons jamais réussi à la détecter lorsqu' elle était exprimée directement dans les cellules Huh- 7 . 4 . L' impact du niveau d' expression de CD81 dans l' infection par le VHC Durant ma thèse , nous avons également étudié l' impact du niveau d' expression de CD81 dans l' infection par le VHC . Cette analyse a été possible par l' observation que des VHCcc hautement infectieuses ( Delgrange et al. , 2007 ) avaient un effet cytopathique sur les cellules Huh- 7 . Néanmoins un certain nombre de cellules resistantes ont pu être isolées . Nous avons appelé cette population cellulaire R1 , pour population résistante 1 . Après traitement à l' IFN- ? , une dilution limite de la population R1 a été réalisée permettant l' isolement de plusieurs clones cellulaires indépendants . La population R1 présentait des niveaux réduits d' infection par le VHC et les différents clones cellulaires indépendants présentaient des niveaux d' infection variables par les VHCcc . La transfection de ces différents clones cellulaires par de l' ARN viral indiquait que la synthèse des protéines virales et la réplication du génome n' étaient pas affectées dans la majorité des clones cellulaires , à l' exception du clone 6 . De plus , l' assemblage et la sécrétion des nouvelles particules virales dans les différents clones cellulaires était équivalente aux cellules Huh- 7 d' origine . L' analyse de leur niveau d' infection par les VHCpp nous a permis de montrer qu' en effet c' était l' étape de l' entrée virale qui était affectée dans ces différents clones . Afin de caractériser la variation observée dans cette étape du cycle , nous avons mesuré les niveaux d' expression de surface des principales molécules jouant un rôle dans l' entrée virale : SR-BI , CLDN- 1 et la tétraspanine CD81 . De manière intéressante , les niveaux variables d' infection étaient directement corrélés aux niveaux d' expression de surface de CD81 , alors que les expressions de SR-BI et CLDN- 1 , dans tous les clones indépendants et dans la population R1 , étaient similaires aux cellules Huh- 7 . Des expériences de détection de l' expression totale de CD81 par western-blot indiquaient que ces cellules présentaient en effet des niveaux variables d' expression totale de la protéine . Certains clones cellulaires , comme le clone 1 , présentaient des niveaux intermédiaires d' expression de CD81 et d' infection par le VHC , entre les niveaux des Huh- 7 d' origine et de la population R1 . Le clone 6 présentait des niveaux d' expression de CD81 et d' infection par les VHCpp similaires aux cellules Huh- 7 . Cependant , l' étape de la réplication du génome était affectée , car le niveau d' infection par les VHCcc était réduit . Enfin , plusieurs clones , comme le clone 7 , n' étaient pas infectables et présentaient des niveaux réduits ou indétectables de CD81 . Nos résultats sont en accord avec deux études récentes sur l' importance des niveaux d' expression de CD81 à la surface des cellules pour leur susceptibilité à l' infection ( Akazawa et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , Koutsoudakis et collaborateurs ont suggèré qu' un niveau seuil d' expression de CD81 serait limitant pour permettre l' infection par le VHC et qu' à partir de ce seuil , la susceptibilité à l' infection augmente rapidement . Akazawa et collaborateurs ont également isolé plusieurs clones cellulaires indépendants issus de cellules Huh- 7 . Leurs clones cellulaires présentaient une grande hétérogenéité par rapport à la réplication de l' ARN viral , l' infectiosité et l' expression de CD81 , mais de manière générale , les clones qui n' exprimaient pas de CD81 n' étaient pas infectables . Il a été montré que les tétraspanines CD81 , CD9 et CD82 ne sont pas exprimées dans de multiples lignées de myélomes . Cela est lié au fait que les régions des promoteurs de ces tétraspanines sont hyperméthylées , occasionnant des niveaux réduits de leur ARN messagers . La dé-méthylation des promoteurs et la dé-acétylation des histones par les drogues 5- aza-deoxycytidine ( inhibiteur de l' ADN méthyltransférase ) et trichostatine A ( inhibiteur de l' histone déacétylase ) permettent la ré-expression de CD82 ( Drucker et al. , 2006 ) . Dans notre étude , nous avons tenté de traiter les clones R1 qui n' expriment plus de CD81 par ces drogues . Néanmoins , ce type de traitement n' a pas permis de restaurer les niveaux d' expression de CD81 et d' infection par le VHC . La raison pour laquelle l' expression de CD81 est modulée dans les différents clones cellulaires indépendants reste à déterminer . Etant donné que dans les cellules Huh- 7 d' origine les niveaux d' expression de CD81 sont élevés et que la population R1 a été sélectionnée suite à l' infection de cellules Huh- 7 par des VHCcc hautement infectieuses , il serait possible que , dans la population de cellules Huh- 7 , des cellules exprimant des niveaux réduits du facteur d' entrée virale CD81 aient été sélectionnées par l' infection virale . De manière intéressante , nous avons isolé un clone cellulaire , le clone 7 , qui n' exprimait plus de CD81 et qui était résistant à l' infection par le VHC . Ces cellules ont été appelées Huh- 7 w 7 et sont un outil essentiel à l' étude du cycle viral . En effet , nos résultats indiquent que , bien que l' étape d' entrée soit bloquée , ces cellules répliquent le génome normalement après transfection de l' ARN viral . L' assemblage et la sécrétion de nouvelles particules virales a également lieu . Ces cellules permettront donc l' étude détaillée des étapes de réplication et d' assemblage du VHC . Le fait que CD81 soit enrichi dans les exosomes ( Escola et al. , 1998 ) , que les hépatocytes sécrètent ces vésicules ( Thery et al. , 2002 ) et que la co-expression de hCD 81 et E1E2 dans les cellules CHO permette l' expression d' une fraction des glycoprotéines virales dans les exosomes pourraient indiquer que CD81 jouerait un rôle dans l' assemblage des particules virales ( Masciopinto et al. , 2004 ) . Toutefois , nos résultats avec les cellules hépatocytaires Huh- 7 w 7 transfectées avec l' ARN viral suggèrent que CD81 joue un rôle uniquement dans l' étape d' entrée du VHC . De plus , à l' aide des cellules Huh- 7 w 7 , il serait possible de déterminer les résidus de CD81 importants pour l' interaction avec la glycoprotéine virale E2 dans un contexte cellulaire hépatocytaire . Comme cité dans l' introduction , des études récentes ont montré l' importance de l' expression de CD81 entière dans un contexte cellulaire hépatique à l' opposé de l' utilisation de formes solubles de CD81 ou d' autres types cellulaires ( Drummer et al. , 2005 ; Flint et al. , 2006 ) . L' étude de Flint et collaborateurs a montré que l' expression de la CD81 de différentes espèces dans les cellules HepG 2 permet de les rendre permissives à l' infection ( Flint et al. , 2006 ) . Toutefois , cette lignée hépatocytaire est difficile à manipuler et surtout peu permissive à la réplication des VHCcc . Il serait donc intéressant d' exprimer , dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 w 7 , des protéines chimériques entre CD81 et la tétraspanine la plus proche , CD9 , qui ne joue pas un rôle dans l' infection du VHC , comme montré par Zhang et collaborateurs ( Zhang et al. , 2004a ) . D' autre part , il serait également possible d' utiliser les cellules Huh- 7 w 7 pour analyser les domaines et résidus de CD81 impliqués dans l' interaction avec EWI- 2 wint , dans un contexte cellulaire humain . Ces cellules seront également utiles pour l' étude de CD81 en elle-même . Il serait par exemple possible d' analyser les voies de signalisation induites par cette tétraspanine , étudier si ces voies sont importantes pour l' infection du VHC et si elles sont inhibées par EWI- 2 wint . Dans notre travail , nous avons confirmé , à l' aide des cellules Huh- 7 w 7 , que l' absence d' infection était strictement liée à une absence d' expression de CD81 . En effet , l' expression ectopique de la CD81 humaine ( hCD 81 ) dans les cellules Huh- 7 w 7 ( Huh- 7 w 7 / hCD 81 ) permet de restaurer la permissivité aux VHCcc et aux VHCpp de tous les génotypes testés . Ces résultats indiquent que l' entrée virale est modulée par les niveaux d' expression de CD81 à la surface des cellules . 5 . L' entrée du VHC , la composition lipidique membranaire et CD81 associée aux TEM Récemment , Flint et collaborateurs ont montré que l' expression , dans les cellules hépatocytaires humaines HepG 2 , de CD81 issue de différentes espèces permet de les rendre permissives à l' infection par le VHC ( Flint et al. , 2006 ) . Cette étude a montré que CD81 issue de primates , mais également de rongeurs , est capable de permettre l' infection virale . Plus spécifiquement , il ont montré que CD81 d' origine murine ( mCD 81 ) rends les HepG 2 permissives aux VHCpp et VHCcc . Plus spécifiquement , cette étude montrait que ces cellules sont plus permissives aux VHCpp de génotype 1a que celles de génotype 2a ( Flint et al. , 2006 ) . Par contre , ce même type cellulaire ( des HepG 2 exprimant la mCD 81 ) n' était pas permissif aux VHCpp- 1a dans l' étude de Bertaux & Dragic ( Bertaux and Dragic , 2006 ) . Dans notre travail , l' expression ectopique de mCD 81 dans les cellules Huh- 7 w 7 ( Huh- 7 w 7 / mCD 81 ) a également permis de restaurer l' infection par les VHCcc et les VHCpp , notamment celles des génotypes 2a et 4 . Néanmoins , comme Flint et collaborateurs ( Flint et al. , 2006 ) , les niveaux d' infection sur les Huh- 7 w 7 / mCD 81 étaient inférieurs à ceux des Huh- 7 w 7 / hCD 81 . En effet , CD81 issue de différents rongeurs était capable de rendre les HepG 2 permissives à l' infection , mais avec de niveaux réduits en comparaison aux CD81 de primates ( Flint et al. , 2006 ) . Ensemble , ces résultats indiquent que CD81 n' est pas le déterminant de la spécificité d' espèce . L' observation intéressante que les cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 soient permissives à l' infection par le VHC nous a permis d' analyser le rôle de CD81 associée au tetraspanin web dans l' infection virale . Récemment , Silvie et collaborateurs ont généré deux anticorps monoclonaux dirigés contre la mCD 81 , MT81 et MT 81w ( Silvie et al. , 2006a ) . L' anticorps MT81 reconnaît la population globale de mCD 81 dans les cellules , alors que l' anticorps MT 81w ne reconnaît mCD 81 que lorsqu' elle est associée au tetraspanin web . Silvie et collaborateurs ont montré que , dans les cellules hépatocytaires de souris Hepa 1 - 6 , 60 % de la mCD 81 est associée aux TEM ( détectée par le MT 81w ) ( Silvie et al. , 2006a ) . Nos données indiquent que , dans les cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 , le pourcentage de mCD 81 associée au tetraspanin web est plus faible , de l' ordre de 30 % . De plus , la mCD 81 est capable d' interagir avec des partenaires dans un contexte cellulaire humain , notamment avec EWI- 2 . Ainsi , nous avons utilisé ces anticorps afin d' évaluer le rôle de la CD81 murine associée aux TEM dans l' entrée virale . Un tel outil n' existe pas pour la détection de CD81 humaine associée aux TEM . L' anticorps MT81 est capable de neutraliser l' entrée du VHC dans les cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 , alors que l' anticorps MT 81w inhibe peu l' infection , même à des concentrations très élevées . Ces résultats de neutralisation suggérent que CD81 associée aux TEM ne joue pas un rôle majeur dans l' entrée du VHC . Nos données sont différentes de celles publiées par Silvie et collaborateurs sur le rôle de CD81 dans l' infection du parasite qui cause le paludisme , le Plasmodium . Dans leur étude , Silvie et collaborateurs ont montré que les deux anticorps , MT81 et MT 81w , étaient capables de neutraliser l' infection du parasite des rongeurs , Plasmodium yoelii , dans les cellules Hepa 1 - 6 ( Silvie et al. , 2006a ) . Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l' épitope de CD81 reconnu par l' anticorps MT 81w ne participe pas à l' interaction avec le VHC , ni que l' inhibition partielle de cet anticorps soit le reflet d' une reconnaissance partielle de CD81 associée aux TEM . Afin de confirmer l' absence de rôle de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le VHC , nous avons utilisé la M ? CD , qui extrait le cholestérol membranaire . Il a été montré que le traitement des cellules avec la M ? CD inhibe l' entrée virale et que le réapprovisionnement des cellules en cholestérol après le traitement avec la M ? CD permet de restaurer l' infection par le VHC ( Kapadia et al. , 2007 ) . Nos résultats confirment l' importance du cholestérol pour l' entrée virale . En effet , la M ? CD inhibe l' infection du VHC dans les cellules Huh- 7 et Huh- 7 w 7 / mCD 81 de manière dose dépendante . Le réapprovisionnement des cellules en cholestérol après le traitement avec la M ? CD permet de restaurer les niveaux d' infection par le VHC dans les deux types cellulaires analysés . Par contre , ils sont similaires entre les cellules enrichies avec du cholestérol en comparaison aux cellules non traitées . Kapadia et collaborateurs ont montré que l' inhibition de l' entrée virale induite par le traitement des cellules avec la M ? CD est liée à une diminution de l' expression de CD81 à la surface des cellules et que le réapprovisionnement des cellules en cholestérol après le traitement avec la M ? CD permet de restaurer les niveaux d' expression de CD81 à la surface ( Kapadia et al. , 2007 ) . CD81 est en effet associée au cholestérol membranaire ( Charrin et al. , 2003c ) . En accord avec ces résultats , le traitement avec la M ? CD des cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 diminue la quantité totale de mCD 81 et le réapprovisionnement des cellules en cholestérol restaure les niveaux d' expression . Par contre , la réduction de hCD 81 dans les cellules Huh- 7 suite au traitement avec la M ? CD n' est pas significative , indiquant que dans ces cellules l' inhibition de l' infection serait plutôt liée à une diminution de la concentration en cholestérol dans la membrane plasmique . De manière intéressante , le marquage de mCD 81 associée au tetraspanin web ( détecté par l' anticorps MT 81w ) après traitement des cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 avec la M ? CD ne varie pas . Alors que ce traitement inhibe l' infection par le VHC . Ces résultats confirment que la CD81 associée aux TEM ne participe pas à l' infection par le VHC . Le réapprovisionnement de cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 en cholestérol après le traitement avec la M ? CD n' a également pas d' effet sur CD81 associée aux TEM , alors que l' enrichissement des cellules en cholestérol augmente le marquage de l' anticorps MT 81w . Nos résultats sont néanmoins différents de ceux publiés pour l' infection hépatique de Plasmodium . En effet , Silvie et collaborateurs ont montré que le traitement des Hepa 1 - 6 avec la M ? CD diminue uniquement le marquage de MT 81w , sans altérer celui de MT81 . De même , le réapprovisionnement des cellules en cholestérol ou leur enrichissement avec du cholestérol induit l' augmentation de CD81 associée au tetraspanin webs , sans faire varier les niveaux totaux de CD81 ( Silvie et al. , 2006a ) . Les différences entre nos travaux pourraient être dues au fait que dans notre étude la mCD 81 est exprimée dans un contexte cellulaire humain et non murin . Bien que les Hepa 1 - 6 soient également des hépatocytes , ils appartiennent à une autre espèce , leurs tetraspanin web pourraient alors être différents . Dans ce sens , les cellules Hepa 1 - 6 expriment la tétraspanine CD9 , tandis que cette protéine n' est pas présente dans les cellules Huh- 7 , ni dans les cellules Huh- 7 w 7 . De plus , CD9 joue un rôle dans la reconnaissance de mCD 81 par l' anticorps MT 81w ( Silvie et al. , 2006a ) . La reconnaissance de mCD 81 dans le contexte cellulaire des Huh- 7 w 7 pourrait alors être différente . Par ailleurs , CD81 est importante pour l' infection hépatique du Plasmodium , mais elle n' est pas responsable directement de l' entrée du parasite , puisqu' aucune interaction directe entre CD81 et Plasmodium n' a pu être démontrée jusqu'à présent . Les différentes études de Silvie et collaborateurs suggèrent qu' une protéine partenaire de CD81 pourrait être responsable de l' entrée du parasite dans les hépatocytes ( Silvie et al. , 2006a ; Silvie et al. , 2006b ; Silvie et al. , 2003 ) , en accord avec le rôle de CD81 associée aux TEM dans l' infection parasitaire . A l' inverse , CD81 en elle-même est essentielle à l' entrée du VHC dans les hépatocytes . Elle interagit physiquement avec la glycoprotéine virale E2 . Ces différences pourraient expliquer les différents rôles de CD81 associée aux tetraspanin web observées entre les mécanismes d' infection hépatiques du VHC et du Plasmodium . Le fait que CD81 associée aux TEM ne participe pas à l' infection du VHC a été confirmé également par le traitement des cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 avec la sphingomyélinase ( Smase ) . Il a été montré que le traitement de cellules Huh- 7 avec cette enzyme , qui transforme les sphingomyélines de la membrane plasmique en céramides , inhibe l' entrée du VHC dans les cellules , en induisant l' internalisation de CD81 ( Voisset et al. , 2007 ) . De manière similaire , dans notre étude , le traitement des cellules Huh- 7 et Huh- 7 w 7 / mCD 81 avec la Smase réduit l' infection par des VHCcc et VHCpp . Les niveaux d' expression de CD81 sont réduits dans les Huh- 7 traitées , alors que ceux de la tétraspanine CD151 ne sont pas affectés , indiquant que les effets sont spécifiques de CD81 . De manière intéressante , le traitement Smase des cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 réduit également la quantité de mCD 81 totale , détectée par l' anticorps MT81 . Par contre , la quantité de mCD 81 associée aux TEM augmente par rapport aux cellules non traitées . La transformation des sphingomyélines en céramides à la membrane plasmique induit à la fois l' inhibition de l' entrée du VHC et l' internalisation de CD81 et la relocalisation de la CD81 restante vers le tetraspanin web . Il serait alors possible que les céramides fassent partie de la composition de TEM . L' inhibition de l' infection par la Smase pourrait alors se faire par une relocalisation de CD81 vers ce domaine . Une autre hypothèse serait que la quantité globale de CD81 pourrait être réduite à des niveaux inférieurs au seuil nécessaire pour que l' infection ait lieu . L' enrichissement de la membrane en céramides pourrait également induire le rassemblement ( clustering ) de CD81 , augmentant la reconnaissance de l' anticorps MT 81w . Cet anticorps pourrait également reconnaître un épitope de CD81 qui serait plus exposé suite à l' enrichissement de la membrane en céramides . La palmitoylation est une modification post-traductionnelle des tétraspanines qui joue un rôle important dans l' organisation des TEM . Bertaux et collaborateurs ont montré qu' un mutant de CD81 avec ses sites de palmitoylation absents est capable de permettre l' infection par les VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ) . Leurs résultats indiquent que CD81 est capable de permettre l' infection même sans interagir avec le tetraspanin web . En accord avec ces résultats , nous avons montré que CD81 associée aux TEM ne participe pas à l' infection par le VHC . Nous avons également montré que le partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , présent dans certaines lignées cellulaires et absent des hépatocytes , bloque l' entrée du virus . A l' aide des cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 et des anticorps dirigés contre la mCD 81 , MT81 et MT 81w , il serait intéressant d' analyser si l' inhibition de l' entrée induite par EWI- 2 wint est médiée par une relocalisation de CD81 vers les TEM . Dans ce sens , EWI- 2 provoque une réorganisation des complexes à tétraspanines à la surface des cellules , avec redistribution de CD81 vers les filipodes ( Stipp et al. , 2003a ) et modification de la reconnaissance de CD81 par certains anticorps ( Kolesnikova et al. , 2004 ) . Nos résultats préliminaires indiquent que lorsqu' EWI- 2 , avec le site de clivage de la furine , est exprimée de manière transitoire dans les cellules Huh- 7 w 7 / mCD 81 , EWI- 2 et EWI- 2 wint sont co-immunoprécipitées par les anticorps MT81 et MT 81w . Des expériences supplémentaires seront réalisées avec des lignées Huh- 7 w 7 co-exprimant de façon stable EWI- 2 wint et mCD 81 . De manière intéressante , le partenaire de CD81 , EWI-F , module négativement l' infection hépatique du Plasmodium . Par contre , ce rôle inhibiteur d' EWI-F ne semble pas lié à une interaction directe entre EWI-F et le parasite , car des anticorps anti-EWI-F et une forme recombinante soluble d' EWI-F n' ont aucune action sur l' infection par les sporozoïtes de P. yoelii . La surexpression d' EWI-F induit une diminution du ratio MT 81w / MT 81 dans les cellules Hepa 1 - 6 , suggérant qu' elle entre en compétition pour l' association à CD81 avec une autre protéine associée à CD81 , qui jouerait un rôle essentiel au cours de l' infection du Plasmodium ( Silvie O. , Abache T. , Billard M. , Franetich J . - F . , Hannoun L. , van Germert G . - J . , Luty A. , Boucheix C. , Mazier D. and Rubinstein E. , The CD81 molecular partner EWI-F exerts a negative effect on host cell infection by Plasmodium yoelii sporozoites , thèse de doctorat de l' Université de Paris 6 présentée par Olivier Silvie le 26 janvier 2006 ; http ) . Bien que cette étude ait montré qu' EWI- 2 ne semble pas jouer un rôle de récepteur pour Plasmodium , ni être impliquée au cours de l' infection , il serait intéressant d' analyser si l' expression d' EWI- 2 wint dans les hépatocytes pourrait inhiber l' entrée des sporozoïtes de Plasmodium . 6 . Hypothèses pour l' entrée du VHC Le mécanisme d' entrée du VHC dans ses cellules cibles n' est pas encore complètement établi . Les données obtenues jusqu'à présent par les différents groupes indiquent que l' attachement du virus à la surface des cellules serait médié par les GAG et le LDL-R. Le virus interagirait avec SR-BI , CD81 et ensuite avec les CLDN , ce qui induirait les évènements conduisant à l' internalisation du complexe virus-récepteur et à la fusion des membranes virales et cellulaires . CD81 pourrait d' ailleurs contribuer aux phénomènes de remaniements membranaires conduisant à la fusion de ces membranes . La composition lipidique membranaire est extrêmement importante pour l' entrée virale , notamment la teneur en cholestérol . Nous avons montré que le traitement des cellules avec la M ? CD réduit la quantité de CD81 à la surface , mais augmente la quantité de SR-BI , en accord avec les résultats de Kapadia et collaborateurs ( Kapadia et al. , 2007 ) . Dans leur étude , Kapadia et collaborateurs suggèrent que le rôle de SR-BI serait secondaire par rapport à celui de CD81 , ou que leurs niveaux d' expression nécessaires pour que l' infection ait lieu seraient différents ( Kapadia et al. , 2007 ) . Toutefois , il est important de noter que la distribution du cholestérol dans les membranes est très dynamique ( Lange and Steck , 1998 ) et que CD81 et SR-BI pourraient être présentes dans différents domaines lipidiques membranaires . En effet , le traitement des cellules avec la Smase , qui diminue la quantité de CD81 , n' a pas d' effet sur l' expression de SR-BI à la surface , en accord avec Voisset et collaborateurs ( Voisset et al. , 2007 ) . Etant donné que la Smase diminue la quantité de sphingomyélines à la membrane plasmique , CD81 serait plutôt présente dans les domaines riches en sphingolipides . SR-BI serait quand à elle plutôt présente dans les domaines riches en phospholipides ( Adachi and Tsujimoto , 2006 ) . Des facteurs cellulaires et des facteurs présents dans le sérum , notamment des lipoprotéines , moduleraient l' entrée du VHC . Le rôle des lipides dans l' infection a été suggéré notamment par l' association des particules virales avec les LDL et VLDL dans le sérum des patients ( Andre et al. , 2002 ) . Les particules virales ainsi dotées de facteurs cellulaires pourraient s' attacher en premier lieu à des récepteurs ayant une affinité pour ces différentes molécules , tels que l' héparane sulfate , le LDL-R et SR-BI . L' interaction des lipoprotéines avec leur récepteur pourrait libérer les glycoprotéines d' enveloppe , permettant l' interaction de E2 avec CD81 ( Figure 30 ) . Figure 30 . Représentation schématique de l' entrée du VHC dans ses cellules cibles avec les molécules influençant l' entrée virale . Différentes molécules présentes dans le sérum sont capables de moduler l' entrée du VHC . C' est le cas des HDL , qui facilitent l' entrée , des LDL oxydées , de la de la LPL et de la SAA , qui inhibent cette même étape . Le partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , est exprimé dans certaines lignées cellulaires et bloque l' entrée du VHC . Il a été montré que les LDL oxydées inhibent l' entrée ( von Hahn et al. , 2006 ) , alors que les HDL augmentent l' infection virale ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) ( Figure 30 ) . Tous les deux agissent à une étape dépendante de SR-BI , molécule qui participe au transfert lipidique entre les cellules et le milieu extracellulaire . Une autre lipoprotéine capable d' inhiber l' infection est la LPL , qui permet une interaction indirecte entre le VHC et les GAG ( Andreo et al. , 2007 ) ( Figure 30 ) . De plus , la SAA , apolipoprotéine produite dans le foie pendant une inflammation , inhibe l' entrée en interagissant avec les particules virales ( Cai et al. , 2007 ; Lavie et al. , 2006 ) ( Figure 30 ) . D' autre part , de manière originale , nous avons montré que l' entrée du VHC est également modulée par le partenaire de CD81 , EWI- 2 wint . Cette protéine , présente dans certaines lignées cellulaires et absente des hépatocytes , est capable de bloquer l' infection virale ( Figure 30 ) . Les hépatocytes étant des cellules polarisées , il n' est pas encore connu si l' endocytose du virus a lieu au pôle basolatéral , en contact avec les capillaires sinusoïdes , ou au pôle apical , en contact avec les canalicules biliaires ( Figure 31 ) . Figure 31 . Représentation schématique de l' entrée du VHC dans les hépatocytes polarisés . Deux hypothèses pour expliquer le mécanisme d' entrée du VHC dans les hépatocytes , des cellules polarisées . L' attachement du VHC au pôle basolatéral des cellules se fait via son interaction avec le LDL-R et les GAG , ensuite le virus interagit avec les molécules d' entrée SR-BI et CD81 , et est transféré vers les régions de membrane riches en CLDN , pour ensuite être internalisé par des vésicules recouvertes de clathrine vers les endosomes précoces , où le pH acide déclenche le processus de fusion . Une autre hypothèse serait que lors de son interaction avec les CLDN , le virus est dirigé vers le pôle apical des cellules , où l' endocytose aurait lieu . Une fois le complexe virus-récepteurs formé à la surface basolatérale des hépatocytes , il pourrait être relocalisé au niveau des jonctions serrées , qui délimitent les surfaces apicale et baso-latérale , où l' endocytose dépendante de la clathrine pourrait être induite ( Figure 31 , panel de droite ) . Dans ce sens , il a été montré que les VHCpp infectent préférentiellement les cellules polarisées Caco- 2 par leur surface apicale ( Mee et al. , 2008 ) . Dans certaines lignées cellulaires mobiles , les tétraspanines sont localisées au niveau des jonctions serrées ( Yanez-Mo et al. , 1998 ) et il est connu que CD81 est capable de relocaliser des complexes membranaires à la surface des cellules . La relocalisation du complexe virus-récepteurs vers la surface apicale pourrait alors être induite par CD81 . Dans ce sens , des drogues qui déstabilisent l' actine , comme la latrunculine A , bloquent la relocalisation de complexes E2 / CD81 vers les régions de contacts entre les cellules hépatocytaires et réduisent l' infectiosité des VHCcc ( Brazzoli et al. , 2008 ) . De plus , la dissociation des structures de type jonctions serrées de cellules Huh- 7 diminue les niveaux d' infection par le VHC , indiquant que ces structures sont importantes pour l' entrée virale ( Brazzoli et al. , 2008 ) . La relocalisation du complexe virus-récepteurs a déjà été observé pour le coxsackievirus B. En effet , ce virus interagit avec le facteur accélérateur de la dissociation ( DAF , de l' anglais decay accelerating accelerating factor ) au niveau de la face apicale de ses cellules cibles , ensuite il est latéralement acheminé jusqu'aux jonctions serrées . Ce virus induit une dissociation des jonctions serrées de manière à pouvoir interagir avec la protéine CAR qui se trouve du côté basolatéral des jonctions ( Coyne and Bergelson , 2006 ) . A l' inverse du VHC , le coxsackievirus B entre en contact avec ses cellules cibles par la surface apicale , alors que le récepteur CAR se trouve à la surface basolatérale . Toutefois , pour le VHC , le contact avec les hépatocytes se fait par la surface basolatérale , qui présente tous les récepteurs connus nécessaires à son internalisation . Par ailleurs , les études qui suggèrent une entrée virale par le pôle apical ont été réalisées en culture cellulaire , cependant la polarisation des hépatocytes dans le foie n' est probablement pas la même que celle des lignées hépatocytaires en culture . De plus , la question persiste si le virus serait capable de survivre à la bile si son internalisation se faisait au pôle apical des hépatocytes . L' internalisation du VHC pourrait alors se faire au pôle basolatéral ( Figure 31 , panel de gauche ) . Dans ce sens , il a été montré que l' expression de CD81 , SR-BI et CLDN- 1 est plus importante à la surface basolatérale des cellules Caco- 2 polarisées ( Mee et al. , 2008 ) , et qu' un mutant de CLDN- 1 , qui n' est plus capable d' interagir avec les autres protéines des jonctions serrées , est toujours capable de restaurer de l' infectivité ( Harris et al. , 2008 ) . Ceci indique que la formation des jonctions serrées n' est pas essentielle à l' entrée virale . Ce mutant est également capable de s' associer à CD81 ( Harris et al. , 2008 ) , et la CLDN- 1 s' associe aux tétraspanines CD9 , CD81 et CD151 en dehors des jonctions serrées ( Kovalenko et al. , 2007 ) . Ensemble , ces données pourraient suggérer que l' entrée virale est médiée par la CLDN- 1 présente dans le tetraspanin web et interagissant avec CD81 . Toutefois , nous avons montré que CD81 associée aux microdomaines enrichis en tétraspanines ne jouent pas un rôle majeur dans l' entrée virale . L' entrée du VHC serait plutôt médiée par des molécules de CD81 qui ne sont pas associées au tetraspanin web . La population de CD81 conférant la permissivité au VHC pourrait être déjà associée aux autres molécules jouant un rôle dans l' entrée virale , notamment la CLDN- 1 , en dehors des TEM , ou ces associations pourraient être induites suite à l' interaction avec le virus . Conclusion Dans notre travail , nous avons montré que le niveau d' expression de CD81 à la surface des cellules est limitant pour l' infection du VHC et que des niveaux variables d' expression de CD81 sont corrélés à des niveaux variables d' infection virale . De plus , nous avons isolé un clone cellulaire humain , appelé Huh- 7 w 7 , qui n' exprime plus de hCD 81 . L' expression ectopique de CD81 murine dans ces cellules nous a permis de démontrer que la population de CD81 responsable de l' entrée du VHC n' est pas associée aux microdomaines enrichis en tétraspanines . Plusieurs molécules semblent impliquées dans le mécanisme d' entrée du VHC . Néanmoins , celles  -ci ne sont pas suffisantes pour conférer l' hépatotropisme de ce virus . Nous avons fait l' observation originale que certaines lignées cellulaires expriment EWI- 2 wint , un partenaire de CD81 capable de bloquer l' entrée du VHC . Par contre , les hépatocytes ne l' expriment pas . Sur base de ces résultats , nous pouvons émettre l' hypothèse que l' hépatotropisme du VHC ne serait pas lié uniquement à la présence d' un récepteur ou co-récepteur spécifique présent au niveau des hépatocytes , mais également à l' absence d' un inhibiteur spécifique , EWI- 2 wint , au niveau de ces cellules . Cette observation nous permet d' envisager qu' un tel mécanisme pourrait également réguler l' entrée d' autres pathogènes dans leur cellules cibles . Bibliographie Accapezzato , D . , Francavilla , V. , Rawson , P. , Cerino , A . , Cividini , A . , Mondelli , M.U . and Barnaba , V . 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